Biosynthesis of cannabinoid precursor olivetolic acid in genetically engineered Yarrowia lipolytica
- 作者
- Jingbo Ma, Yang Gu, Peng Xu
- 单位
- Department of Chemical, Biochemical and Environmental Engineering, University of Maryland Baltimore County; 华中农业大学; 其他单位（原文未明确列出所有作者单位，此处仅按可获取信息）
- 杂志
- Communications Biology（2022）
- DOI
- 10.1038/s42003-022-04202-1
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
在解脂耶氏酵母中高效合成大麻素前体橄榄醇酸（OLA），解决己酰辅酶A、丙二酰辅酶A、乙酰辅酶A、NADPH和ATP等前体供应不足的瓶颈问题。
研究策略
采用逆向工程策略，系统鉴定OLA合成途径的限速步骤，通过筛选高效己酰辅酶A合成酶、增强丙二酰辅酶A和乙酰辅酶A供应、提供NADPH和ATP、调节过氧化物酶体β-氧化以及控制发酵pH等手段，逐步提高OLA产量。
核心内容
该研究通过逆向工程策略，在解脂耶氏酵母中系统构建并优化了大麻素前体橄榄醇酸（OLA）的合成途径。研究者首先在酵母中表达大麻来源的橄榄醇酸合酶和环化酶，随后逐步解除前体供应瓶颈。关键创新在于引入恶臭假单胞菌来源的短链酰基辅酶A合成酶PpLvaE，高效转化己酸为己酰辅酶A，使产量从初始的0.11 mg/L提升至1.07 mg/L。在此基础上，通过过表达去内含子的内源乙酰辅酶A羧化酶增强丙二酰辅酶A供应、引入丙酮酸脱氢酶旁路和乙酰辅酶A合成酶突变体强化乙酰辅酶A供给、表达苹果酸酶补充NADPH、并激活过氧化物酶体β-氧化及ATP转运通路，结合CaCO₃控制发酵pH，最终工程菌YL128在摇瓶中OLA产量达9.18 mg/L，比初始菌株提高83倍，较酿酒酵母报道水平高出3倍。该工作系统解析了OLA合成中的多重限速步骤，证明产油酵母具备合成大麻素前体的潜力，为在解脂耶氏酵母中工程化完整大麻素生物合成途径奠定了基线策略。
创新点
首次利用恶臭假单胞菌LvaE短链酰基辅酶A合成酶高效转化己酸为己酰辅酶A；组合多种代谢工程策略（过表达ACC、丙酮酸脱氢酶旁路、苹果酸酶、过氧化物酶体β-氧化激活及ATP输出通路）实现OLA产量83倍提升。
研究对象（10）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Yarrowia lipolytica | 大麻素前体橄榄醇酸合成途径 | CoSOLS | 橄榄醇酸合酶（四酮合酶，来自Cannabis sativa） | 催化 | 催化己酰辅酶A与3分子丙二酰辅酶A缩合 |
| Yarrowia lipolytica | 大麻素前体橄榄醇酸合成途径 | CoOAC | 橄榄醇酸环化酶（来自Cannabis sativa） | 催化 | 与CoSOLS共同催化OLA生成 |
| Yarrowia lipolytica | 己酰辅酶A合成 | PpLvaE | 短链酰基辅酶A合成酶（来自Pseudomonas putida KT2440） | 催化 | 高效转化外源己酸为己酰辅酶A，使OLA产量提高8倍 |
| Yarrowia lipolytica | 丙二酰辅酶A合成 | ylACC1 | 乙酰辅酶A羧化酶 | 催化 | 去除内含子后过表达，提高丙二酰辅酶A供应，OLA产量被提升1.8倍 |
| Yarrowia lipolytica | 乙酰辅酶A合成 | ylPEX10 | 过氧化物酶体基质蛋白Pex10 | 区室化 | 激活过氧化物酶体β-氧化，促进乙酰辅酶A生成 |
| Yarrowia lipolytica | 乙酰辅酶A合成 | SeAcsL641P | 乙酰辅酶A合成酶突变体（来自Salmonella enterica） | 催化 | 提高乙酰辅酶A合成 |
| Yarrowia lipolytica | 乙酰辅酶A合成 | EcPDH, EcLpIA | 丙酮酸脱氢酶复合物及硫辛酸蛋白连接酶A（来自E. coli） | 催化 | 将丙酮酸转化为乙酰辅酶A，形成丙酮酸脱氢酶旁路 |
| Yarrowia lipolytica | NADPH供应 | ylMAE1, McMAE2 | 苹果酸酶（来自Yarrowia lipolytica和Mucor circinelloides） | 能量供给 | 催化苹果酸生成丙酮酸并产生NADPH，为OLA合成提供还原力 |
| Yarrowia lipolytica | ATP转运 | ylANT1 | 过氧化物酶体ATP/AMP转运蛋白 | 转运 | 将ATP转运入过氧化物酶体，增强β-氧化并增加胞质乙酰辅酶A |
| Yarrowia lipolytica | 脂质合成竞争途径 | ylDGA1, ylDGA2 | 二酰甘油酰基转移酶 | 催化 | 敲除以减少酰基辅酶A流向甘油三酯，但实际OLA产量下降，可能引起反馈抑制 |
关键发现
- 初始菌株YL101仅产OLA 0.11 mg/L
- 表达PpLvaE后产量达1.07 mg/L（提高8倍）
- 过表达内源ACC1（去内含子）后产量达1.9 mg/L（提高1.8倍）
- 使用CaCO3控制pH后产量达5.86 mg/L（提高3倍）
- 整合表达ylPEX10、SeAcsL641P和EcPDH后产量达7.43 mg/L
- 最终工程菌YL128在摇瓶中OLA产量达9.18 mg/L，比初始菌株提高83倍，比酿酒酵母摇瓶报道产量高3倍。
研究结论
通过系统性解除前体供应瓶颈，成功在产油酵母解脂耶氏酵母中实现橄榄醇酸的显著合成，为在产油酵母中工程化大麻素生物合成提供了基线策略。