Engineering a promiscuous preyltransferase for selective biosynthesis of an undescribed bioactive cannabinoid analog
- 作者
- Qin Yan, Yue-Gui Chen, Xiao-Wen Yang, An Wang, Xiao-Ping He, Xue Tang, Hong Hu, Kai Guo, Zong-Hua Xiao, Yan Liu, Sheng-Hong Li
- 杂志
- Communications Biology（2025）
- DOI
- 10.1038/s42003-025-07509-x
- 所属领域
- 合成生物学
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解决的核心问题
利用混杂的芳香异戊烯基转移酶在大肠杆菌中合成具有多样异戊烯基侧链的生物活性大麻素类似物，特别是获得一种未描述的新化合物4，并通过酶工程提高其选择性和产量。
研究策略
将真菌芳香异戊烯基转移酶AscC引入含有外源甲羟戊酸（MVA）途径的工程大肠杆菌中，利用不同的异戊烯基二磷酸供体合成大麻素类似物；通过分子对接和定点突变对AscC进行工程改造，获得选择性产生化合物4的突变体；并通过增加AscC基因拷贝数提高产物产量。
核心内容
本研究将真菌来源的混杂芳香异戊烯基转移酶AscC引入携带外源甲羟戊酸（MVA）途径的工程大肠杆菌中，以橄榄醇酸为底物合成了带有C5、C10和C15异戊烯基侧链的大麻素类似物，其中新化合物4为C-5位连接法尼基的未描述结构。通过分子对接与定点突变，获得突变体L180Y和L180F，可选择性产生化合物4，产量分别达11.71和12.95 mg/L，而Y222L和Y222F几乎丧失活性。额外增加AscC基因拷贝数后，化合物4产量从7.31提升至14.85 mg/L，总产物中底物转化率达70.48%。活性评价显示，化合物4对TNF-α和IL-6分泌的IC50分别为3.06和4.31 μM，对金黄色葡萄球菌等革兰氏阳性菌的EC50在0.87–3.16 μM之间，显著优于其他类似物。该工作展示了通过混杂酶工程在微生物中多样化合成大麻素类似物的可行性，并提供了具有抗炎和抗菌潜力的新先导化合物。
创新点
['首次将真菌混杂芳香异戊烯基转移酶AscC应用于大肠杆菌中，合成了带有C5、C10、C15异戊烯基侧链的大麻素类似物', '发现并鉴定了新化合物4（2,4-二羟基-5-[(2E,6E)-3,7,11-三甲基-1,2,6,10-十二碳三烯-1-基]-6-戊基苯甲酸），其C-5位连接C15法尼基', '通过结构指导的酶工程获得突变体L180Y和L180F，能够选择性产生化合物4', '化合物4展现出显著的抗神经炎症和抗革兰氏阳性菌活性，IC50和EC50值达到微摩尔水平']
研究对象（8）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21(DE3) | 甲羟戊酸（MVA）通路 | AscC | AscC（UbiA型芳香异戊烯基转移酶） | 催化 | 来自Fusarium sp. NBRC 100844，催化橄榄醇酸（OA）与C5-C15异戊烯基二磷酸的C-C Friedel-Crafts烷基化反应，生成化合物1-4 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 甲羟戊酸（MVA）通路 | AscC(L180Y) | AscC突变体（L180Y） | 催化 | 通过定点突变获得，选择性催化OA的C-5位异戊烯基化，专一产生化合物4，产量达11.71 mg/L |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 甲羟戊酸（MVA）通路 | AscC(L180F) | AscC突变体（L180F） | 催化 | 通过定点突变获得，选择性产生化合物4，产量达12.95 mg/L |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 甲羟戊酸（MVA）通路 | FDPS | 法尼基二磷酸合酶 | 催化 | 催化异戊烯基二磷酸生成法尼基二磷酸（FDP），为C15异戊烯基化提供前体 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 甲羟戊酸（MVA）通路 | CsPT4 | CsPT4（来自Cannabis sativa的芳香异戊烯基转移酶） | 催化 | 测试其对OA的异戊烯基化活性，但未观察到产物 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 甲羟戊酸（MVA）通路 | Trt2 | Trt2（来自Aspergillus terreus的芳香异戊烯基转移酶） | 催化 | 测试其对OA的异戊烯基化活性，但未观察到产物 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 甲羟戊酸（MVA）通路 | AtaPT | AtaPT（来自Aspergillus terreus的芳香异戊烯基转移酶） | 催化 | 测试其对OA的异戊烯基化活性，但未观察到产物 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 甲羟戊酸（MVA）通路 | Orf2 | Orf2（来自Streptomyces sp.的芳香异戊烯基转移酶） | 催化 | 测试其对OA的异戊烯基化活性，但未观察到产物 |
关键发现
- ['工程大肠杆菌（含pBbA5c-MevT-MBIS和pET28a/AscC）通过喂食橄榄醇酸（OA）可产生四种异戊烯基化产物，其中OA转化率为70.48%', '化合物1-4的产量分别为0.12±0.02、0.08±0.01、0.38±0.05和7.31±0.60 mg/L', '在额外引入一个AscC拷贝（pCold-TF/AscC）后，化合物1-4的产量提高至2.06±0.10、1.63±0.12、0.91±0.09和14.85±0.91 mg/L，分别提高17.85、20.80、2.42和2.03倍', '化合物4对TNF-α和IL-6分泌的IC50分别为3.06 μM和4.31 μM
- 对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和藤黄微球菌的EC50分别为0.87±0.14、2.08±0.12和3.16±0.42 μM', '突变体L180Y和L180F选择性产生化合物4，产量分别为11.71和12.95 mg/L
- Y222L和Y222F产量仅为野生型的21%和0.4%', '化合物1-3在20 μM时对TNF-α和IL-6的抑制率为34.29-48.17%，而化合物4的抑制率达85.35%和81.08%']
研究结论
通过将混杂的芳香异戊烯基转移酶AscC引入工程大肠杆菌，成功合成了具有不同异戊烯基侧链的大麻素类似物，其中新化合物4具有显著的抗神经炎症和抗菌活性。通过酶工程改造，获得了能够选择性产生化合物4的突变体L180Y和L180F，提高了目标产物的纯度。增加AscC基因拷贝数有效提高了产物产量。该研究为通过组合生物学生产多样化的大麻素类似物提供了新策略。