A versatile regulatory toolkit of arabinose-inducible artificial transcription factors for Enterobacteriaceae
- 作者
- Gita Naseri, Hannah Raasch, Emmanuelle Charpentier, Marc Erhardt
- 单位
- Max Planck Unit for the Science of Pathogens; Max Planck Institute for Infection Biology; Institute for Biology, Humboldt University Berlin
- 杂志
- Communications Biology（2023）
- DOI
- 10.1038/s42003-023-05363-3
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
在肠杆菌科（尤其是 Salmonella enterica 和 Escherichia coli）中缺乏可诱导、可调、正交的人工转录因子（ATFs）工具，难以精确控制基因表达以用于基础研究和生物技术应用。
研究策略
采用 CRISPR/dCas9 和拟南芥来源的植物转录因子作为 DNA 结合结构域，融合 SoxS(R93A) 激活结构域，构建阿拉伯糖诱导的 ATF 文库；通过改造 Salmonella 的阿拉伯糖代谢和转运系统优化诱导窗口，并应用于生物传感器和β-胡萝卜素生产。
核心内容
本研究针对肠杆菌科细菌缺乏可诱导、可调且正交的人工转录因子（ATF）工具的问题，开发了一套基于阿拉伯糖诱导的ATF文库。研究人员将CRISPR/dCas9系统及拟南芥来源的植物转录因子（JUB1、ANAC102、GRF9）作为DNA结合结构域，融合SoxS(R93A)激活结构域，构建了多种ATF。通过删除Salmonella的araBAD基因并组成型表达araE转运蛋白，使PBAD驱动的基因表达增强约4.5-6.5倍。在优化遗传背景下，JUB1来源的ATF在0.05%阿拉伯糖诱导时实现了约35倍的基因表达诱导。该工具成功应用于两个场景：构建双输入生物传感器SALSOR 0.2用于检测多种生物碱，以及在E. coli中利用JUB1-ATF控制crtEBIY操纵子，使β-胡萝卜素产量达组成型强启动子的约2.1倍。研究表明，该阿拉伯糖诱导ATF文库可在肠杆菌科实现宽动态范围、可调的基因表达，为合成生物学中的基因调控和代谢工程提供了灵活工具。
创新点
开发了基于 CRISPR/dCas9 和植物来源转录因子（JUB1、ANAC102、GRF9）的阿拉伯糖诱导 ATF 文库；改造 Salmonella 阿拉伯糖代谢途径实现约4.5-6.5倍 PBAD 表达增强；优化出0.01%-0.1%阿拉伯糖诱导窗口；构建了双输入生物传感器 SALSOR 0.2；利用植物来源 ATF 提高 β-胡萝卜素产量约2.1倍。
研究对象（7）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Salmonella enterica serovar Typhimurium LT2 | L-阿拉伯糖代谢 | araBAD, araE, araC | AraB, AraA, AraD, AraE, AraC | 催化 | araBAD 编码阿拉伯糖分解酶；araE 编码阿拉伯糖转运蛋白；araC 编码调控蛋白。 |
| Salmonella enterica serovar Typhimurium LT2 | 阿拉伯糖诱导表达系统 | PBAD | AraC | 调控 | 阿拉伯糖诱导启动子，受 AraC 调控。 |
| Escherichia coli | CRISPR/dCas9 基因激活 | dCas9, scRNA, MCP-SoxS(R93A) | dCas9, MCP, SoxS(R93A) | 调控 | dCas9 为 DNA 结合结构域，MCP-SoxS(R93A) 为激活结构域，通过 MS2 发夹招募。 |
| Salmonella enterica serovar Typhimurium LT2 | 植物转录因子调控 | JUB1, ANAC102, GRF9, SoxS(R93A) | JUB1, ANAC102, GRF9, SoxS(R93A) | 调控 | 植物来源全长 TF 或其 DBD 与 SoxS(R93A) 融合形成 ATF。 |
| Salmonella enterica serovar Typhimurium LT2 | 生物碱生物传感器 | ramR, sGFP | RamR | 调控 | RamR 为多药耐药阻遏蛋白，用于检测生物碱。 |
| Escherichia coli | β-胡萝卜素生物合成 | crtE, crtB, crtI, crtY | CrtE, CrtB, CrtI, CrtY | 催化 | crtEBIY 操纵子编码 FPP 转化为 β-胡萝卜素的酶。 |
| Escherichia coli | β-胡萝卜素生物合成 | pK2151200, pK2151201, pCAROTENE5X | — | 调控 | pK2151200 无启动子，pK2151201 组成型启动子 J23106，pCAROTENE5X 含5个 JUB1 结合位点的合成启动子。 |
关键发现
- 在 Salmonella 中，删除 araBAD 并组成型表达 araE（PproA）后，PBAD 驱动的基因表达增强约4.5-6.5倍。
- CRISPR/dCas9 来源的 ATF 在 Salmonella M9 培养基中诱导16倍（J105），在 LB 中2.5倍；在 E. coli 中最高7倍（8h诱导）。
- JUB1 来源 ATF 在 Salmonella 中与2个结合位点组合，0.05%阿拉伯糖诱导时得到约29倍诱导（M9），在优化遗传背景下达35倍诱导。
- SALSOR
- 2 生物传感器对 NOS、ROTU、THP 的信噪比分别为约1.2、1.3、1.8倍（SALSOR
- 1）而 SALSOR
- 2 显著提高。
- 在 E. coli 中使用 JUB1-ATF 控制 crtEBIY 操纵子，β-胡萝卜素产量为组成型强启动子的约2.1倍，诱导时间从4h延长至8h产量增加约40%。
研究结论
本研究开发的阿拉伯糖诱导 ATF 文库能够在 Salmonella 和 E. coli 中实现宽动态范围、可调的基因表达，为肠杆菌科的合成生物学应用提供了有力工具，并成功应用于生物传感和代谢工程。