Combining systems and synthetic biology for in vivo enzymology
- 作者
- Sara Castano-Cerezo, Alexandre Chamas, Hanna Kulyk, Christian Treitz, Floriant Bellvert, Andreas Tholey, Virginie Galéote, Carole Camarasa, Stéphanie Heux, Luis F Garcia-Alles, Pierre Millard, Gilles Truan
- 杂志
- The EMBO Journal（2024）
- DOI
- 10.1038/s44318-024-00251-w
- 所属领域
- 代谢工程/合成生物学
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
体外酶学参数测定条件与细胞内环境差异大，难以反映真实生理状态，且膜结合酶或多聚酶难以体外纯化和测定，需要开发直接在细胞内测定酶动力学参数的方法。
研究策略
结合合成生物学工具（通过调控底物合成酶的表达和基因拷贝数，在酵母中构建底物浓度大范围变化的菌株系列）和系统生物学工具（基于绝对定量代谢组学、通量组学和蛋白质组学数据），在稳态指数生长期采集数据，用Michaelis-Menten模型拟合得到体内酶动力学参数。
核心内容
本研究开发了一种通用的体内酶学方法，将合成生物学工具与系统生物学方法相结合。具体而言，通过调控底物合成酶表达及基因拷贝数，在酿酒酵母中构建了底物（GGPP）浓度范围大幅变化的菌株系列，并借助绝对定量代谢组学、通量组学和蛋白质组学数据，在指数生长期稳态下用Michaelis-Menten模型拟合获得体内酶动力学参数。利用该方法成功测定了帕氏泛菌八氢番茄红素合酶PaCrtB及两种真菌八氢番茄红素脱氢酶XdCrtI、BtCrtI的体内参数。结果显示PaCrtB的体内K1/2为19±3 μM，低于其体外KM（41 μM），表明体内亲和力更高；XdCrtI的K1/2为380±49 μM，kcat为0.030±0.006 s⁻¹；PaCrtI因未达饱和仅获得参数下限。体内底物/酶比例范围宽达8至2500，且各菌株生长速率相近（0.40±0.03 h⁻¹）。该工作证明体内参数与体外存在显著差异，强调了在真实细胞环境中评估膜结合酶或多聚酶功能的必要性，所建立的菌株平台可重复用于下游酶的测定，实现了“即插即测”的便利性。
创新点
['提出了一种通用的体内酶学方法，将合成生物学用于底物浓度调控，系统生物学用于定量测量和建模', '首次成功测定了帕氏泛菌八氢番茄红素合酶（PaCrtB）和两种真菌八氢番茄红素脱氢酶（XdCrtI、BtCrtI）的体内动力学参数', '发现体内与体外参数存在显著差异，强调了在真实细胞环境中测定酶参数的必要性', '该方法特别适用于难以体外研究的膜结合酶和多聚酶', '同一套菌株平台可重复用于下游酶的测定，实现了‘即插即测’']
研究对象（8）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2-1C | 类胡萝卜素生物合成途径 | crtB (来自Pantoea ananas) | PaCrtB (八氢番茄红素合酶) | 催化 | 研究对象，催化GGPP缩合生成八氢番茄红素 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2-1C | 类胡萝卜素生物合成途径 | crtI (来自Pantoea ananas) | PaCrtI (八氢番茄红素脱氢酶) | 催化 | 研究对象，催化八氢番茄红素脱氢生成番茄红素 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2-1C | 类胡萝卜素生物合成途径 | crtI (来自Xanthophyllomyces dendrorhous) | XdCrtI (八氢番茄红素脱氢酶) | 催化 | 研究对象，真菌来源的八氢番茄红素脱氢酶 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2-1C | 类胡萝卜素生物合成途径 | crtI (来自Blakeslea trispora) | BtCrtI (八氢番茄红素脱氢酶) | 催化 | 研究对象，真菌来源的八氢番茄红素脱氢酶 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2-1C | 类胡萝卜素生物合成途径 | crtE (不同微生物来源) | GGPP合酶 | 催化 | 用于调节细胞内GGPP浓度的工具酶 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2-1C | 甲羟戊酸途径/萜类前体合成 | ERG20 | 法尼基焦磷酸合酶 | 催化 | 过表达以增加GGPP前体供应 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2-1C | 甲羟戊酸途径 | HMG1 (截短形式) | HMG-CoA还原酶 | 催化 | 过表达以增强甲羟戊酸途径通量 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2-1C | 萜类代谢 | DPP1 | 磷酸酶 (二异戊烯基焦磷酸酶) | 催化 | 敲除以减少GGPP的降解 |
关键发现
- ['GGPP浓度在构建的菌株中变化38倍，且各菌株生长速率相近（0.40±0.03 h⁻¹）', '在中度PaCrtB表达水平下，GGPP浓度变化167倍（0.12–20.78 μM），达到部分饱和', 'PaCrtB体内参数：Vmax=849±71 μM/h，K1/2=19±3 μM，kcat=6±1 s⁻¹（酶浓度42 nM）
- 体外KM=41 μM，体内亲和力更高', 'XdCrtI体内参数：Vmax=168±7 μM/h，K1/2=380±49 μM，kcat=0.030±0.006 s⁻¹', 'BtCrtI体内参数：Vmax=309±22 μM/h，K1/2=41±12 μM', 'PaCrtI由于未饱和，仅得到下限：Vmax≥13 μM/h，K1/2≥560 μM', '番茄红素浓度超过400 μM时，比生长速率下降约50%', '体内底物/酶比例在PaCrtB为8–1400，在XdCrtI为2–2500']
研究结论
本研究开发了一种结合合成生物学和系统生物学的体内酶学方法，成功测定了类胡萝卜素合成途径中八氢番茄红素合酶和两种八氢番茄红素脱氢酶的体内动力学参数，发现体内与体外参数存在差异，证明了该方法在真实细胞环境中评估酶功能（尤其是膜结合酶）的可行性和价值。