Structure-guided product determination of the bacterial type II diterpene synthase Tpn2
- 作者
- Emma A. Stowell, Michelle A. Ehrenberger, Ya-Lin Lin, Chin-Yuan Chang, Jeffrey D. Rudolf
- 杂志
- Communications Chemistry（2022）
- DOI
- 10.1038/s42004-022-00765-6
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
细菌II型二萜合酶的序列-结构-功能关系不清，无法从蛋白序列预测其产物（如克罗烷/拉布烷/卤烷骨架），本文旨在通过解析Tpn2结构和突变研究阐明产物选择性决定机制。
研究策略
以Tpn2为模型，通过X射线晶体学解析其结构，结合分子对接和定点突变（如G485D）改变产物特异性，并利用体内萜类过表达系统（MK14系统）验证产物，最后通过生物信息学（SSN和GNN）对细菌II型TS进行家族分类和功能预测。
研究路线图
核心内容
本研究以细菌II型二萜合酶Tpn2为模型，通过X射线晶体学解析其2.57 Å分辨率结构，首次获得了产生克罗烷骨架的细菌II型二萜合酶三维结构。结合分子对接、定点突变和体内萜类过表达系统（MK14系统）验证，系统阐明了该酶的产物选择性决定机制。野生型Tpn2催化GGPP生成terpendetienyl二磷酸（TPP），经去磷酸化后得到syn-kolavenol；而单残基突变G485D可将产物由克罗烷骨架转变为拉布烷骨架的syn-柯巴基焦磷酸，进而生成syn-sclarene，产量达8.0 mg/L。此外，Tpn2-Tpn3融合蛋白产生terpentetriene，产量9.0 mg/L。突变体活性分析证实D296、H342、K383和Y489为催化必需残基。序列相似性网络分析鉴定出964个细菌II型萜合酶并分为4个主要亚家族，其中含108个成员的一个家族尚无功能表征。该工作揭示了单残基开关控制克罗烷与拉布烷骨架形成的关键机制，表明细菌萜烯合酶功能多样性远超目前认知，为基因组挖掘发现新型细菌萜类化合物奠定了结构基础。
创新点
首次报道了产生克罗烷骨架的细菌II型二萜合酶晶体结构（第三个细菌II型TS结构）；发现G485单残基开关可切换克罗烷/拉布烷产物；产生了第一个细菌来源的syn-CPP合酶。
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21 Star (DE3) | 二萜生物合成（异戊烯醇激酶途径，MK14系统） | tpn2-tpn3 (融合蛋白) | Tpn2-Tpn3融合蛋白 | 催化 | 用于体内生产terpentetriene (3) 和syn-sclarene (5) |
| Escherichia coli NiCo(DE3) | 蛋白异源表达 | tpn2 | Tpn2 | 催化 | 用于体外酶活测定及晶体结构解析 |
| — | 二萜环化 | tpn2(G485D) | Tpn2G485D突变体 | 催化 | 单残基开关，将克罗烷产物转变为syn-CPP，进而经Tpn3生成syn-sclarene |
| — | 二萜生物合成 | tpn3 | Tpn3 (I型二萜合酶) | 催化 | 消除TPP或syn-CPP的二磷酸基团，生成terpentetriene或syn-sclarene |
| — | 萜类前体供给 | tpn6 | GGPP合酶 | 催化 | 位于tpn BGC中，负责合成GGPP（基于基因簇预测，未在本研究实验验证） |
| — | 细菌II型二萜合酶比较 | ptmT2, rv3377c | PtmT2, Rv3377c | 催化 | 结构比对和序列分析中的参考酶，分别产生ent-CPP和halimane骨架 |
关键发现
- ['Tpn2晶体结构分辨率2.57 Å，是第三个细菌II型TS结构，也是首个克罗烷合酶结构。', 'Tpn2催化GGPP生成terpendetienyl二磷酸（TPP）
- 产物经去磷酸化后为syn-kolavenol，经NMR确认。', '单残基突变G485D将产物从克罗烷（TPP）转变为syn-柯巴基焦磷酸（syn-CPP），进而生成syn-sclarene，产量8.0 mg/L
- 野生型Tpn2-Tpn3融合蛋白产生terpentetriene，产量9.0 mg/L。', 'G485D和G485E突变体中terpentetriene (3) 与syn-sclarene (5) 比例分别为1.6:1和2.3:1。', 'D296A、H342A/F、K383A、Y489A、H180F/V突变体均完全失活，证实D296、H342、K383和Y489为催化必需残基。', '序列相似性网络分析鉴定964个细菌II型TS，分为4个主要亚家族，其中1个含108个TS的家族尚无功能表征，可能与鲨烯-藿烯环化酶相似。']
研究结论
本研究通过Tpn2的结构和功能分析揭示了细菌II型二萜合酶中一个单残基开关控制克罗烷与拉布烷骨架的形成，表明细菌萜烯合酶的功能多样性远超目前认知，为通过基因组挖掘发现新型细菌萜类化合物奠定了基础。