Generation of structurally novel short carotenoids and study of their biological activity
- 作者
- Se H. Kim, Moon S. Kim, Bun Y. Lee, Pyung C. Lee
- 杂志
- Scientific Reports（2016）
- DOI
- 10.1038/srep21987
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
缺乏对C30类胡萝卜素作为生物活性化合物的探索，以及如何生成结构新颖的短链类胡萝卜素。
研究策略
结合定向进化和组合生物合成，利用来自多种微生物的天然类胡萝卜素酶和定向进化突变酶（CrtN、CrtY），在大肠杆菌中重构C30类胡萝卜素生物合成途径，生成多种结构新颖的C30和C35类胡萝卜素，并评估其生物活性。
核心内容
该研究通过定向进化与组合生物合成策略，在大肠杆菌中重构了C30类胡萝卜素生物合成途径。研究者将来自多种微生物的天然类胡萝卜素酶与经定向进化的突变酶CrtN和CrtY组合使用，成功生成了13种结构新颖的C30类胡萝卜素（包括无环、单环和双环结构）及1种C35类胡萝卜素4,4'-diapononaflavaxanthin。DPPH自由基清除实验显示，无环C30类胡萝卜素的IC50值介于7.5至11.6 μM之间，均优于对照DL-α-生育酚（33.2 μM），其中4,4'-diapolycopene-4,4'-dial活性最强（IC50=7.5 μM）；而环状C30类胡萝卜素活性较低，如4,4'-diapotorulene的IC50为70.3 μM。此外，50 μM 4,4'-diapotorulene处理大鼠骨髓间充质干细胞7天约导致20%细胞死亡，并诱导细胞呈现神经元样形态，提示其具有潜在神经分化活性。该工作证明代谢工程可高效合成结构多样的短链类胡萝卜素，为药物和化妆品领域提供了新的候选化合物。
创新点
通过定向进化CrtN和CrtY优化了C30类胡萝卜素途径，生成了13种结构新颖的C30类胡萝卜素和1种C35类胡萝卜素，包括无环、单环和双环结构；首次证明无环C30类胡萝卜素的自由基清除活性优于DL-α-生育酚，并发现单环C30类胡萝卜素4,4'-diapotorulene具有神经分化活性。
研究对象（12）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli | C30类胡萝卜素生物合成 | crtM | CrtM | 催化 | 4,4'-diapophytoene synthase，来自Staphylococcus aureus，催化合成C30前体4,4'-diapophytoene |
| Escherichia coli | C30类胡萝卜素生物合成 | crtN | CrtN | 催化 | 4,4'-diapophytoene desaturase，来自Staphylococcus aureus，经定向进化获得突变体以改变脱氢活性和底物选择性 |
| Escherichia coli | C30类胡萝卜素生物合成 | crtEb | CrtEb | 催化 | lycopene elongase，来自Corynebacterium glutamicum，催化IPP延伸生成C35类胡萝卜素4,4'-diapononaflavaxanthin |
| Escherichia coli | C30类胡萝卜素生物合成 | crtA | CrtA | 催化 | spheroidene monooxygenase，来自Rhodobacter capsulatus，催化引入酮基生成4,4'-diapolycopene-4,4'-dial等 |
| Escherichia coli | C30类胡萝卜素生物合成 | crtD | CrtD | 催化 | carotene 3,4-desaturase，来自Rhodobacter capsulatus，参与不饱和键形成 |
| Escherichia coli | C30类胡萝卜素生物合成 | crtY | CrtY | 催化 | lycopene cyclase，多种来源（Brevibacterium linens、Pantoea agglomerans等），其中CrtY_BL经定向进化提高对C30底物的环化选择性，生成单环和双环C30类胡萝卜素 |
| Escherichia coli | C30类胡萝卜素生物合成 | crtP | CrtP | 催化 | 4,4'-diaponeurosporene oxidase，来自Staphylococcus aureus，催化末端氧化生成醛 |
| Escherichia coli | C30类胡萝卜素生物合成 | aldH | AldH | 催化 | aldehyde dehydrogenase，来自Staphylococcus aureus，催化醛基氧化为羧基 |
| Escherichia coli | C30类胡萝卜素生物合成 | crtZ | CrtZ | 催化 | β-carotene hydroxylase，来自Pantoea agglomerans，催化β-紫罗兰酮环羟基化 |
| Escherichia coli | C30类胡萝卜素生物合成 | crtO | CrtO | 催化 | carotene ketolase，来自Synechocystis sp. PCC 6803，催化酮基引入 |
| Escherichia coli | C30类胡萝卜素生物合成 | crtW | CrtW | 催化 | carotene ketolase，来自Nostoc sp. PCC 7120，催化羟基-β-紫罗兰酮环上加酮基 |
| Escherichia coli | C30类胡萝卜素生物合成 | crtX | CrtX | 催化 | zeaxanthin glucosyltransferase，来自Pantoea agglomerans，催化葡萄糖基转移 |
关键发现
- 通过组合生物合成在大肠杆菌中产生了13种结构新颖的C30类胡萝卜素（无环、单环、双环）和1种C35类胡萝卜素（4,4'-diapononaflavaxanthin）。DPPH自由基清除实验显示，无环C30类胡萝卜素的IC50值在7.5-11.6 μM之间，均低于DL-α-生育酚（33.2 μM），其中4,4'-diapolycopene-4,4'-dial活性最强（IC50=7.5 μM），4,4'-diapolycopene IC50=8.7 μM，diaponeurosporenoic acid IC50=9.7 μM，diaponeurosporen-al IC50=10.2 μM，diaponeurosporene IC50=11.6 μM
- 而环状C30类胡萝卜素活性较低（4,4'-diapotorulene IC50=70.3 μM，4,4'-diapo-β-carotene IC50=77.8 μM）。此外，50 μM 4,4'-diapotorulene处理大鼠骨髓间充质干细胞7天约导致20%细胞死亡，并诱导细胞呈现神经元样形态。
研究结论
本研究证明，通过代谢工程和组合生物合成，可在E. coli中高效合成结构新颖且具有潜在生物活性的短链C30类胡萝卜素，为药物、化妆品等领域的应用提供了新候选物；但需进一步研究其详细的生理活性。