Methyl jasmonate induction of tanshinone biosynthesis in Salvia miltiorrhiza hairy roots is mediated by JASMONATE ZIM-DOMAIN repressor proteins

作者: Min Shi, Wei Zhou, Jianlin Zhang, Shengxiong Huang, Huizhong Wang, Guoyin Kai
杂志: Scientific Reports（2016）
DOI: 10.1038/srep20919
所属领域: 代谢工程/植物次生代谢
关键词: JASMONATE ZIM-DOMAINSalvia miltiorrhizahairy rootsmethyl jasmonaterepressor proteinstanshinone biosynthesis
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解决的核心问题

解析茉莉酸甲酯（MJ）诱导丹参毛状根中丹参酮生物合成的分子调控机制，特别是JAZ家族抑制蛋白在其中的作用。

研究策略

从丹参毛状根中克隆两个新的JAZ基因（SmJAZ3和SmJAZ9），通过过表达和反义抑制策略改变其在转基因毛状根中的表达水平，结合qRT-PCR、HPLC、亚细胞定位和酵母双杂交等分析，研究其对丹参酮生物合成的影响及调控机制。

研究路线图

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核心内容

该研究从丹参毛状根中克隆了两个新的JAZ家族基因SmJAZ3和SmJAZ9，并系统探究了它们在茉莉酸甲酯（MJ）诱导丹参酮生物合成中的调控作用。通过转基因过表达和反义抑制策略改变这两个基因在毛状根中的表达水平，结合qRT-PCR、HPLC、亚细胞定位及酵母双杂交等手段进行分析。结果显示，MJ处理1小时后SmJAZ3和SmJAZ9表达量分别达到对照的约6倍和8倍；过表达SmJAZ3使丹参酮产量降至0.077 mg/g DW，较对照（1.37 mg/g DW）降低约94%，而抑制SmJAZ3表达可使丹参酮含量增至4.78 mg/g DW，达到对照的2.48倍。抑制SmJAZ9的效果相对较弱，含量最高为对照的1.35倍。在SmJAZ3过表达系中，关键合成基因SmKSL表达下调约20倍，而SmCPS上调2–6倍。酵母双杂交显示SmJAZ9能与AtMYC2互作，而SmJAZ3未检测到互作。该研究证实SmJAZ3和SmJAZ9是JA信号通路负调控因子，其中SmJAZ3对丹参酮的抑制作用更强，为丹参酮产量的代谢工程改造提供了新的靶点。

创新点

首次克隆并功能鉴定了丹参中两个JAZ蛋白SmJAZ3和SmJAZ9，证明它们作为JA信号通路中的负调控因子参与丹参酮生物合成的调控，并发现SmJAZ3对丹参酮的抑制作用强于SmJAZ9。

研究对象（9）

底盘细胞	代谢通路	基因	蛋白	功能	说明
Salvia miltiorrhiza hairy roots	JA信号通路/丹参酮生物合成	SmJAZ3	SmJAZ3	调控	JA信号通路抑制因子，过表达降低丹参酮产量，定位于细胞核。
Salvia miltiorrhiza hairy roots	JA信号通路/丹参酮生物合成	SmJAZ9	SmJAZ9	调控	JA信号通路抑制因子，过表达降低丹参酮产量，主要定位于细胞核，可与AtMYC2互作。
Salvia miltiorrhiza hairy roots	丹参酮生物合成（MEP/MVA途径）	SmGGPPS	Geranylgeranyl diphosphate synthase	催化	丹参酮合成关键酶，SmJAZ3过表达时其表达下调。
Salvia miltiorrhiza hairy roots	丹参酮生物合成（MEP途径）	SmDXS2	1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase	催化	MEP途径关键酶，SmJAZ3过表达时其表达下调。
Salvia miltiorrhiza hairy roots	丹参酮生物合成	SmKSL	Kaurene synthase-like	催化	丹参酮合成相关酶，SmJAZ3过表达时表达显著降低（约20倍）。
Salvia miltiorrhiza hairy roots	丹参酮生物合成	SmCPS	Copalyl diphosphate synthase	催化	SmJAZ3过表达时表达上调2-6倍。
Salvia miltiorrhiza hairy roots	丹参酮生物合成	SmCYP76AH1	Cytochrome P450 76AH1	催化	丹参酮生物合成酶，在SmJAZ3过表达时无明显变化。
Saccharomyces cerevisiae AH109（酵母双杂交）	JA信号通路	AtMYC2	AtMYC2	调控	作为诱饵蛋白验证与SmJAZ的相互作用，结果显示SmJAZ9与AtMYC2互作。
Nicotiana benthamiana（本氏烟草）	亚细胞定位	SmJAZ3, SmJAZ9	SmJAZ3, SmJAZ9	调控	用于亚细胞定位实验，SmJAZ3定位于细胞核，SmJAZ9主要定位于细胞核。

关键发现

SmJAZ3和SmJAZ9在MJ处理后1小时表达量分别达到峰值，约为对照的6倍和8倍。过表达SmJAZ3使丹参酮产量降至0.077 mg/g DW（对照为1.37 mg/g DW），降低94%
过表达SmJAZ9的品系中丹参酮产量最低降至0.266 mg/g DW。抑制SmJAZ3（anti-SmJAZ3-3）使丹参酮含量增至4.78 mg/g DW，为对照的2.48倍
抑制SmJAZ9（anti-SmJAZ9-23）使含量增至3.22 mg/g DW，为对照的1.35倍。在SmJAZ3过表达系中，丹参酮合成关键基因SmKSL表达显著下调（约20倍），SmCPS表达上调2-6倍，SmCYP76AH1无明显变化。酵母双杂交显示SmJAZ9能与AtMYC2相互作用，而SmJAZ3未检测到互作。

研究结论

SmJAZ3和SmJAZ9是丹参中JA信号通路的抑制性转录调控因子，负调控丹参酮生物合成；SmJAZ3的抑制作用强于SmJAZ9。该研究为深入解析MJ诱导丹参酮合成的分子机制及丹参酮产量的代谢工程改造奠定了基础。