Functional characterization of ent-copally diphosphate synthase, kaurene synthase and kaurene oxidase in the Salvia miltiorrhiza gibberellin biosynthetic pathway
- 作者
- Ping Su, Yuru Tong, Qiqing Cheng, Yating Hu, Meng Zhang, Jian Yang, Zhongqiu Teng, Wei Gao, Luqi Huang
- 杂志
- Scientific Reports（2016）
- DOI
- 10.1038/srep23057
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
解析丹参赤霉素生物合成途径中ent-copally diphosphate synthase（SmCPSent）、kaurene synthase（SmKS）和kaurene oxidase（SmKO）三个酶的功能，阐明从GGPP到ent-kaurenoic acid的代谢步骤。
研究策略
从丹参毛状根中克隆SmCPSent、SmKS和SmKO基因，在酿酒酵母BY-T20菌株中异源表达，通过共表达和蛋白融合策略进行功能表征，并构建融合酶SmKS-SmCPSent提高ent-kaurene产量，同时共表达NADPH-细胞色素P450还原酶SmCPR1以支持SmKO的氧化反应。
核心内容
本研究从丹参毛状根中克隆了赤霉素生物合成途径的三个关键酶基因SmCPSent、SmKS和SmKO，并在酿酒酵母BY-T20株中异源表达以解析其功能。SmCPSent含DIDD基序，催化GGPP环化生成ent-CPP；SmKS含DDFFD基序，与SmKSL2有99%氨基酸同一性，催化ent-CPP生成ent-kaurene；SmKO与AtKO和PsKO分别有64%和66%同一性，催化ent-kaurene三步氧化为ent-kaurenoic acid。通过构建SmKS-SmCPSent融合蛋白，ent-kaurene产量较分开表达提高约4.25倍；共表达SmKO与NADPH-细胞色素P450还原酶SmCPR1后检测到ent-kaurenoic acid甲酯产物，完整验证了从GGPP到ent-kaurenoic acid的三步酶促反应。该工作首次在丹参中功能表征了这三个连续酶，表明蛋白融合策略可有效提升异源二萜产量，为后续表征GA途径下游酶及通过调控GA途径改善丹参生长和丹参酮积累奠定了基础。
创新点
首次在丹参中功能表征了赤霉素生物合成途径中的三个连续酶；构建了SmKS-SmCPSent融合蛋白，使ent-kaurene产量比分开表达提高约4.25倍；通过酵母异源表达系统完整验证了从GGPP到ent-kaurenoic acid的三步途径。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae BY-T20 | 赤霉素生物合成途径 | SmCPSent | ent-copally diphosphate synthase | 催化 | 催化GGPP环化生成ent-CPP，含DIDD基序，属于II类二萜合酶 |
| Saccharomyces cerevisiae BY-T20 | 赤霉素生物合成途径 | SmKS | kaurene synthase | 催化 | 催化ent-CPP生成ent-kaurene，含DDFFD基序，属于I类二萜合酶 |
| Saccharomyces cerevisiae BY-T20 | 赤霉素生物合成途径 | SmKO | kaurene oxidase | 催化 | 细胞色素P450酶，催化ent-kaurene三步氧化生成ent-kaurenoic acid |
| Saccharomyces cerevisiae BY-T20 | 赤霉素生物合成途径 | SmCPR1 | NADPH-细胞色素P450还原酶 | 能量供给 | 为SmKO提供还原力（NADPH-derived electrons），支持P450催化反应 |
| Saccharomyces cerevisiae BY-T20 | 赤霉素生物合成途径 | SmKS-SmCPSent（融合基因） | SmKS-SmCPSent fusion protein | 催化 | 通过GGGS连接肽融合SmKS和SmCPSent，提高ent-kaurene产量约4.25倍 |
关键发现
- SmCPSent全长cDNA为2413 nt，编码793氨基酸，含有DIDD基序，催化GGPP环化生成ent-CPP
- SmKS cDNA为2636 nt，编码806氨基酸，与SmKSL2有99%氨基酸同一性，含有DDFFD基序，催化ent-CPP生成ent-kaurene
- SmKO cDNA为1930 nt，编码519氨基酸，与AtKO和PsKO分别有64%和66%同一性，催化ent-kaurene的三步氧化生成ent-kaurenoic acid
- 融合酶SmKS-SmCPSent在酵母中使ent-kaurene产量比单独表达SmCPSent和SmKS提高约4.25倍
- 共表达SmKO和SmCPR1后检测到ent-kaurenoic acid甲酯产物。
研究结论
明确了丹参赤霉素生物合成途径中从GGPP到ent-kaurenoic acid的三步酶促反应，即SmCPSent、SmKS和SmKO依次催化；蛋白融合是提高异源二萜产物产量的有效策略；该研究为后续表征GA途径下游酶（如SmKAO和CYP88A亚家族）以及通过调控GA途径改善丹参生长和丹参酮积累奠定了基础。