Specialized activities and expression differences for Clostridium thermocellum biofilm and planktonic cells
- 作者
- Alexandru Dumitrache, Dawn M. Klingeman, Jace Natzke, Miguel Rodriguez Jr, Richard J. Giannone, Robert L. Hettich, Brian H. Davison, Steven D. Brown
- 杂志
- Scientific Reports（2017）
- DOI
- 10.1038/srep43583
- 所属领域
- 微生物学
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
比较 Clostridium thermocellum 在纤维素发酵过程中附着态（生物膜）和浮游态细胞的基因表达差异，揭示两种细胞群体对底物可利用性的生理适应及其在生物转化和培养生长中的贡献。
研究策略
设计一种新型生物反应器（不锈钢网袋快速收集生物膜），在相同培养条件下同时分离固着态和浮游态细胞，利用 RNA-Seq 和蛋白质组学进行全转录组和蛋白质组比较分析。
研究路线图
核心内容
本研究通过自主设计的新型生物反应器（不锈钢网袋快速收集系统），在同一培养条件下实现了热纤梭菌（Clostridium thermocellum ATCC 27405）附着态（生物膜）与浮游态细胞的同步分离，并结合RNA-Seq转录组与蛋白质组学开展了两种细胞群体的独立比较分析。结果显示71.4%的蛋白编码基因（2356个）在两类细胞间差异表达，其中1958个基因差异倍数≥2倍，582个基因≥5倍；浮游细胞在24小时内数量增加100倍，表观倍增时间约0.82小时。生物膜细胞中纤维糊精转运相关的CbpB溶质结合脂蛋白（Cthe_1018-1020）为全基因组最高表达基因，较浮游细胞高2.5倍以上，同时乙酸激酶与磷酸转乙酰酶过表达超过13倍，氢酶及ATP酶复合体表达高2.6–7.4倍，表明附着态细胞是糖分解代谢、能量生成及底物转化的主要功能群体。浮游细胞则显著上调甲酸乙酰转移酶（过表达34倍）、硫氧还蛋白（高36.7倍）、红素氧还蛋白（高33.4倍）及LON/CLP蛋白酶等胁迫响应基因，反映出碳源限制下运动性、趋化性及多种保护机制的激活。这一专门化的生理分工揭示了纤维素附着引发广泛基因表达重塑，为工业菌株的理性工程改造提供了重要靶点。
创新点
开发了可快速分离生物膜与浮游细胞的新型生物反应器；首次对 C. thermocellum 两种细胞群体进行独立的转录组和蛋白质组差异分析；结合多组学数据揭示了附着态和浮游态细胞的专门化生理功能。
研究对象（17）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Clostridium thermocellum ATCC 27405 | 纤维糊精转运 | Cthe_1018-1020 (cbpB) | CbpB solute-binding lipoprotein | 转运 | 生物膜细胞中最高表达基因，结合G2-G5纤维糊精，表达量比浮游细胞高2.5倍以上。 |
| Clostridium thermocellum ATCC 27405 | 糖酵解 | Cthe_0347 | 焦磷酸依赖型6-磷酸果糖激酶 | 催化 | 生物膜细胞中表达高于ATP依赖型同工酶（Cthe_1261），是糖酵解的首选途径。 |
| Clostridium thermocellum ATCC 27405 | 丙酮酸发酵 | Cthe_0505 (pfl) | 甲酸乙酰转移酶 | 催化 | 浮游细胞中过表达34倍，其激活酶Cthe_0506也高表达，是碳限制和氧化还原失衡代谢转换的关键基因。 |
| Clostridium thermocellum ATCC 27405 | 丙酮酸发酵 | Cthe_2390-2932 (pfor) | 丙酮酸铁氧还蛋白氧化还原酶 | 催化 | 生物膜细胞中利用该酶将丙酮酸转化为乙酰辅酶A并还原铁氧还蛋白。 |
| Clostridium thermocellum ATCC 27405 | 氢代谢 | Cthe_0340-0342, Cthe_0428-0430, Cthe_3003, Cthe_3020-3024 | Fe-Fe氢酶和Ni-Fe ech氢酶复合体 | 能量供给 | 四个氢酶系统在生物膜细胞中显著过表达，参与铁氧还蛋白和NADH的再氧化并形成质子梯度。 |
| Clostridium thermocellum ATCC 27405 | ATP合成 | Cthe_2602-2609, Cthe_2262-2269 | F型与V型H+-ATP酶 | 能量供给 | 14个ATP酶基因在生物膜细胞中表达高2.6-7.4倍，表明附着态细胞具有更高的产能潜力。 |
| Clostridium thermocellum ATCC 27405 | 纤维素降解 | Cthe_3077 (cipA) | CipA脚手架蛋白 | 区室化 | 两种细胞群体中均高表达且无显著差异，常作为qPCR参考基因；组织细胞小体装配。 |
| Clostridium thermocellum ATCC 27405 | 纤维素降解 | celS, CtMan5A, celK, cbhA | 细胞小体纤维素酶 | 催化 | 浮游细胞中这些酶表达比生物膜高至少44%，增强游离细胞对碳水化合物的增溶和粘附。 |
| Clostridium thermocellum ATCC 27405 | 氧化应激响应 | Cthe_0360 | 硫氧还蛋白 | 催化 | 浮游细胞中表达高36.7倍，通过还原氧化蛋白维持氧化还原稳态。 |
| Clostridium thermocellum ATCC 27405 | 氧化应激响应 | Cthe_0063, Cthe_2164 | 红素氧还蛋白（Rubredoxin） | 催化 | 浮游细胞中表达高33.4倍，参与厌氧菌中氧和过氧化物还原。 |
| Clostridium thermocellum ATCC 27405 | Fe-S簇组装与修复 | Cthe_0720 (nifS), Cthe_0721 (nifU) | 半胱氨酸脱硫酶 NifS，U型支架蛋白 NifU | 催化 | 浮游细胞中过表达24倍以上，用于组装和修复氧化损伤的Fe-S簇。 |
| Clostridium thermocellum ATCC 27405 | 核苷酸切除修复 | Cthe_0311, Cthe_0309, Cthe_2737, Cthe_0206 | UvrABC切除酶复合体及UvrD解旋酶 | 催化 | 浮游细胞中高表达，其中UvrC高41倍，修复氧化损伤导致的DNA损伤。 |
| Clostridium thermocellum ATCC 27405 | 蛋白质降解 | Cthe_0082, Cthe_2742, Cthe_1216-1217, Cthe_2740-2741, Cthe_1789, Cthe_0312 | LON与CLP蛋白酶 | 催化 | 浮游细胞中表达高8-26倍，选择性降解异常或损伤蛋白质。 |
| Clostridium thermocellum ATCC 27405 | 硫酸盐/铁摄取 | 硫酸盐和Fe(III)ABC转运蛋白基因 | 硫酸盐转运蛋白，Fe(III)转运蛋白 | 转运 | 浮游细胞中上调，以支持Fe-S簇合成和氧化应激响应。 |
| Clostridium thermocellum ATCC 27405 | 趋化性 | 31个趋化基因中的20个 | 趋化蛋白（甲基转移酶、酯酶、膜感受器） | 调控 | 浮游细胞中趋化基因表达更高，帮助细胞感知低碳环境并寻找营养源。 |
| Clostridium thermocellum ATCC 27405 | 吲哚合成 | Cthe_0871-0875 | 吲哚合成通路酶 | 催化 | 浮游细胞中高表达，5个基因均位于浮游表达谱前5%分位，可能参与应激保护和信号传导。 |
| Clostridium thermocellum ATCC 27405 | tRNA硫醇化 | Cthe_0722 | tRNA特异性2-硫代尿苷酸酶 | 调控 | 浮游细胞中表达高17倍，通过tRNA修饰调控翻译能力和代谢稳态。 |
关键发现
- 4% 的蛋白编码基因（2356个）在两种细胞群体间显著差异表达
- 1958个基因（59.3%）差异倍数≥2倍，582个基因≥5倍。浮游细胞在24小时内数量增加100倍，推测表观倍增时间 t_gen=0.82h。生物膜细胞中 CbpB 溶质结合脂蛋白（Cthe_1018-1020）为全基因组最高表达基因，比浮游细胞高2.5倍以上。浮游细胞中甲酸乙酰转移酶（pfl, Cthe_0505）过表达34倍
- 丙酮酸甲酸裂解酶激活基因（Cthe_0506）为浮游细胞第12、14高表达基因。生物膜细胞中乙酸激酶（Cthe_1028）和磷酸转乙酰酶（Cthe_1029）过表达>13倍。氢酶和 ATP 酶复合体在生物膜中表达高2.6-7.4倍。浮游细胞中硫氧还蛋白（Cthe_0360）高36.7倍，红素氧还蛋白（Cthe_0063）高33.4倍，NifS/NifU（Cthe_0720-0721）高>24倍，UvrC（Cthe_2737）高41倍，LON/CLP 蛋白酶高8-26倍。蛋白质组共鉴定1406个基因产物，转录组-蛋白质组相关性达70-75%。乙醇产量为理论值的25%，乙酸:乙醇质量比约2:1.2。
研究结论
附着于纤维素底物的生物膜细胞在糖分解代谢、能量生成、蛋白质和脂质合成以及细胞分裂方面表现出更高的基因表达，是生长和底物转化的主要功能群体；而浮游细胞因碳源限制，激活了运动性、趋化性、纤维素酶表达以及多种胁迫响应和保护机制。研究表明微生物对纤维素的附着会引起广泛的基因表达变化，为工程化工业适用菌株提供了生理学见解。