Transcriptomic insight into terpenoid and carbazole alkaloid biosynthesis, and functional characterization of two terpene synthases in curry tree (Murraya koenigii)
- 作者
- Seema Meena, Sarma Rajeev Kumar, Varun Dwivedi, Anup Kumar Singh, Chandan S. Chanotiya, Md. Qussen Akhtar, Krishna Kumar, Ajit Kumar Shasany, Dinesh A. Nagegowda
- 杂志
- Scientific Reports（2017）
- DOI
- 10.1038/srep44126
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
咖喱树（Murraya koenigii）中萜类和咔唑生物碱生物合成途径的分子基础尚未阐明，缺乏相关基因和酶的功能信息。
研究策略
对咖喱树叶进行转录组测序和denovo组装，通过KEGG/NCBI/UniProt注释挖掘萜类和咔唑生物碱候选基因；克隆两个转录本丰度最高的萜烯合酶基因MKTPS1和MKTPS2，进行亚细胞定位、原核表达、体外酶活分析，并结合组织表达和挥发物分析验证其功能。
核心内容
该研究对咖喱树叶进行了转录组测序与从头组装，得到102857个contigs，其中约90%具有表达信号，并注释到87417个contigs，系统挖掘了萜类和咔唑生物碱生物合成的候选基因。MEP途径和MVA途径分别有60个和43个contigs参与，单萜合酶和倍半萜合酶分别对应36个和70个contigs。研究进一步克隆了表达量最高的两个萜烯合酶基因MKTPS1和MKTPS2，在E. coli中进行异源表达和体外酶活分析，证明重组MkTPS1以GPP为底物特异产生(-)-sabinene，而MkTPS2以FPP为底物产生(E,E)-α-farnesene。组织表达分析显示MkTPS1在成熟叶和绿果中相对表达量分别达到根的11.5倍和13.5倍，与(-)-sabinene是咖喱树叶主要挥发物的检测结果一致。这是对Murraya属植物的首次转录组分析，为咔唑生物碱生物合成相关PKS、PT、MT和CYP450基因提供了重要遗传资源，也为咖喱树萜类代谢工程奠定了基础。
创新点
首次对Murraya属（及Clauseneae族）植物进行转录组分析；功能表征了(-)-sabinene合酶（MkTPS1）和(E,E)-α-farnesene合酶（MkTPS2）；为咔唑生物碱生物合成候选基因（PKS、PT、MT、CYP450）提供了转录组资源。
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli Rosetta-2 | 单萜生物合成 | MKTPS1 | (-)-sabinene synthase | 催化 | 重组蛋白以GPP为底物主要生成(-)-sabinene；FPKM为127.27 |
| Escherichia coli Rosetta-2 | 倍半萜生物合成 | MKTPS2 | (E,E)-α-farnesene synthase | 催化 | 重组蛋白以FPP为底物生成(E,E)-α-farnesene；FPKM为45.83 |
| 拟南芥原生质体 | 亚细胞定位 | MKTPS1-GFP | MkTPS1-GFP融合蛋白 | 区室化 | 定位在质体 |
| 拟南芥原生质体 | 亚细胞定位 | MKTPS2-GFP | MkTPS2-GFP融合蛋白 | 区室化 | 定位在细胞质 |
| Murraya koenigii | MEP途径 | DXS | 1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase | 催化 | 13个contigs，总FPKM 297 |
| Murraya koenigii | 咔唑生物碱生物合成 | MKPKS1-4 | III型聚酮合酶 | 催化 | 44个PKS contigs，鉴定4个全长候选，其中MKPKS2属于非查尔酮型PKSIII，可能参与咔唑生物碱 |
关键发现
- 转录组组装获得102857个contigs（90.28%具有≥1 FPKM），平均转录本长度1163.43 bp，GC含量40.79%
- 注释到87417个contigs。MEP途径7个基因共60个contigs（总FPKM 3413），MVA途径6个基因43个contigs（总FPKM 509）
- 单萜合酶（MTPS）36个contigs（FPKM 2828），倍半萜合酶（STPS）70个contigs（FPKM 1928）。MkTPS1和MkTPS2的FPKM分别为127.27和45.83。重组MkTPS1以GPP为底物产生(-)-sabinene（唯一产物），重组MkTPS2以FPP为底物产生(E,E)-α-farnesene。MkTPS1在成熟叶和绿果中的相对表达量分别为11.5倍和13.5倍（以根为校准），MkTPS2分别为8倍和9倍。MkTPS1与柠檬γ-松油烯合酶（Clγ-TPNS）氨基酸一致性86%，MkTPS2与粗柠檬δ-榄香烯合酶（RlemTPS4）一致性83%。
研究结论
本研究首次报道了咖喱树的叶片转录组，揭示了萜类和咔唑生物碱生物合成相关基因的丰富资源；功能表征了MkTPS1和MkTPS2，证明MkTPS1负责咖喱树叶中主要挥发物(-)-sabinene的形成，而MkTPS2编码(E,E)-α-farnesene合酶但该产物未在叶片挥发物中检测到，可能由于储存或转化。这些数据为咔唑生物碱代谢工程和合成生物学研究奠定了基础。