Rewiring carotenoid biosynthesis in plants using a viral vector
- 作者
- Eszter Majer, Briardo Llorente, Manuel Rodríguez-Concepcion, José-Antonio Darós
- 单位
- Instituto de Biología Molecular y Celular de Plantas, CSIC-Universidad Politécnica de Valencia; Centre for Research in Agricultural Genomics (CRAG), CSIC-IRTA-UAB-UB
- 杂志
- Scientific Reports（2017）
- DOI
- 10.1038/srep41645
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
植物代谢工程常受内源代谢通路复杂调控的限制，难以高效引入和表达异源多步代谢通路；且传统稳定转基因方法耗时耗力。本研究旨在利用病毒载体在植物中快速表达完整异源类胡萝卜素合成通路，实现番茄红素等产物的非质体合成。
研究策略
利用烟草蚀刻病毒（TEV）衍生的病毒载体，将 Pantoea ananatis 的 crtE、crtB、crtI 三个异源酶基因组装成多顺反子表达盒，替换病毒 NIb 顺反子，在烟草细胞质中重构细菌来源的番茄红素生物合成通路；同时利用 crtB 表达引起的内源类胡萝卜素积累和叶绿素减少，开发基于黄色的可视化报告系统。
核心内容
本研究利用烟草蚀刻病毒（TEV）衍生的病毒载体，在植物细胞质中快速重构了来自 Pantoea ananatis 的 crtE、crtB、crtI 三酶类胡萝卜素合成通路，实现番茄红素的非质体合成。通过将三个异源基因组装为多顺反子表达盒并替换病毒 NIb 顺反子，成功在烟草系统叶中检测到八氢番茄红素和番茄红素积累，其中番茄红素约占总类胡萝卜素的10%，达到约150 μg/g干重。研究还意外发现，单独表达 crtB 即可诱导内源类胡萝卜素积累并产生亮黄色表型，β-胡萝卜素和叶黄素含量较空载体对照增加70–75%，叶绿素减少约50%。基于此，研究者开发了广谱的黄色可视报告标记，该标记在TEV、TMV、PVX等多种病毒及烟草、番茄、拟南芥等寄主中均能肉眼可见，并可与花青素红色标记Roseal联用以区分不同病毒的感染区域。该工作证明病毒载体可在植物细胞质中高效表达异源多酶代谢通路，产量与工程酵母相当，同时提供了追踪病毒感染动态的新型可视化工具，拓展了病毒载体在植物代谢工程和植物病毒学研究中的应用。
创新点
首次在植物细胞质中利用病毒载体表达完整的异源三酶类胡萝卜素合成通路，实现番茄红素的非质体合成；意外发现 crtB 可诱导内源类胡萝卜素积累并产生黄色表型，据此开发出广谱的黄色可视标记，可与花青素红色标记 Roseal 联用，同时追踪两种病毒的感染动态。
研究对象（8）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 烟草 (Nicotiana tabacum) | 类胡萝卜素生物合成（异源胞质通路） | crtE | GGPP合酶 (crtE/GGPPS) | 催化 | 来自 Pantoea ananatis，催化 GGPP 合成，作为异源通路第一步 |
| 烟草 (Nicotiana tabacum) | 类胡萝卜素生物合成（异源胞质通路） | crtB | 八氢番茄红素合酶 (PSY) | 催化 | 来自 Pantoea ananatis，催化两分子 GGPP 合成八氢番茄红素；单独表达可诱导内源类胡萝卜素积累并产生黄色表型 |
| 烟草 (Nicotiana tabacum) | 类胡萝卜素生物合成（异源胞质通路） | crtI | 八氢番茄红素脱氢酶 | 催化 | 来自 Pantoea ananatis，催化八氢番茄红素脱氢生成番茄红素 |
| 烟草 (Nicotiana tabacum) | 类异戊二烯前体合成（MVA途径） | 内源MVA途径基因 | 甲羟戊酸途径相关酶 | 能量供给 | 为胞质异源类胡萝卜素合成提供 IPP/DMAPP 前体 |
| 烟草 (Nicotiana tabacum) | 内源类胡萝卜素合成（质体MEP途径） | 内源PSY、PDS、ZDS等 | 内源类胡萝卜素合成酶 | 催化 | crtB 表达后内源质体类胡萝卜素（β-胡萝卜素、叶黄素）含量增加70-75% |
| 烟草 (Nicotiana tabacum) / 本氏烟 / 番茄 / 拟南芥 / 西葫芦 | 花青素生物合成 | Roseal (Ros1) | MYB转录因子Roseal | 调控 | 来自金鱼草，激活花青素合成产生红色，用于与crtB黄色标记联用 |
| 烟草 (Nicotiana tabacum) 等 | 病毒复制与运动 | TEV基因组（NIb等） | TEV复制酶等 | 调控 | TEV载体用于异源基因表达；ΔNIB版本需要转基因互补NIb |
| 烟草 (Nicotiana tabacum) | 类胡萝卜素降解 | CCD（类胡萝卜素裂解双加氧酶） | CCD酶 | 催化 | 推测crtB产生的八氢番茄红素可能被CCD裂解产生信号分子，促进内源类胡萝卜素积累 |
关键发现
- 在 TEVΔNIB-BIE 感染的本氏烟/烟草系统叶中，HPLC 检测到八氢番茄红素和番茄红素积累，番茄红素约占总类胡萝卜素含量的 10%，达到约 150 μg/g 干重。
- 单独表达 crtB 的 TEVΔNIB-B 感染组织呈现亮黄色，β-胡萝卜素和叶黄素含量比空载体对照增加 70-75%，叶绿素含量减少约 50%。
- crtB 黄色标记在 TEV、TMV、PVX、ZYMV 等多种病毒以及烟草、本氏烟、番茄、拟南芥、西葫芦等寄主中均能产生肉眼可见的黄色，且可与 Roseal 红色标记在同一叶片中区分不同病毒感染区域。
- 植物细胞质表达 P. ananatis 的 crtE/crtB/crtI 可实现番茄红素合成，产量与工程酵母相当。
研究结论
利用植物病毒载体可以在植物细胞质中快速重构异源多酶代谢通路，实现番茄红素等类胡萝卜素的非质体合成；同时 crtB 可作为广谱、可视的黄色报告标记，用于追踪植物病毒感染动态，并可与其他颜色标记组合使用。该策略拓展了病毒载体在植物代谢工程和植物病毒学研究中的应用。