Towards preparative-scale, biocatalytic alkene reductions
- 作者
- Despina J. Bougioukou, Adam Z. Walton, Jon D. Stewart
- 杂志
- ChemComm（2010）
- DOI
- 10.1039/c0cc03119d
- 所属领域
- 生物催化
- 关键词
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解决的核心问题
烯烃还原酶催化不对称C=C还原虽在小规模筛选中有良好结果，但缺乏简单、可放大的反应策略以实现克级制备。本文以柠檬醛还原为模型，解决烯烃还原酶制备级应用中底物/产物抑制、羰基还原副反应以及两种对映异构体香茅醛的高选择性获取问题。
研究策略
构建含17种烯烃还原酶的GST融合蛋白库，在E. coli中表达并纯化筛选；针对柠檬醛的几何异构体特性，优化单相/双相反应体系，采用底物补料策略；通过硫酸铵分级沉淀粗酶液消除E. coli内源醇脱氢酶引起的醛过度还原；利用葡萄糖脱氢酶（GDH）实现NADPH再生，并分别用OYE 2.6和NemA催化得到(R)-和(S)-香茅醛。
核心内容
针对烯烃还原酶在制备级不对称C=C还原中缺乏简单可放大策略的问题，该研究以柠檬醛还原为模型，构建了含17种烯烃还原酶的GST融合蛋白库并进行筛选。为消除大肠杆菌内源醇脱氢酶引起的醛过度还原副反应，研究者采用硫酸铵分级沉淀粗酶液，无需基因敲除即可有效抑制羰基还原；同时利用葡萄糖脱氢酶实现NADPH再生，并系统优化了单相与双相反应体系及底物补料策略。结果表明，以纯度>98%的香叶醛为底物时，单相体系结合补料策略在12小时内转化率达86%。在15 mmol规模反应中，硫酸铵处理后的粗酶液含GST-OYE 2.6与GDH，5.75小时转化率达95%，(R)-香茅醛分离收率67%、ee为98%且未检测到香茅醇；含GST-NemA的粗酶液催化橙花醛还原，4小时转化率超98%，(S)-香茅醛收率69%、ee为99%。该方法无需特殊设备、操作简便，可稳定实现克级规模两种对映体香茅醛的高选择性合成，并已推广至其他活化烯烃底物，为合成化学工具箱增添了实用途径。
创新点
['开发了非专业人员可操作、无需特殊设备的制备级生物催化烯烃还原方法', '通过硫酸铵分级沉淀粗酶液，无需基因敲除即可有效抑制羰基还原副反应', '实现了两种对映体香茅醛的高对映选择性合成（(R)-型98% ee，(S)-型99% ee）']
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli | — | — | OYE 2.6 (Pichia stipitis) | 催化 | 旧黄素酶家族烯烃还原酶，还原柠檬醛生成(R)-香茅醛，对香叶醛/橙花醛选择性较小，常与GST融合表达 |
| Escherichia coli | — | nemA | NemA (E. coli) | 催化 | 烯烃还原酶，还原柠檬醛生成(S)-香茅醛，对橙花醛具有高比活 |
| Escherichia coli | — | — | 葡萄糖脱氢酶 (GDH) | 能量供给 | 用于NADPH再生，耦合葡萄糖氧化提供还原力 |
关键发现
- ['双相体系（正己烷/KPi）中，OYE
- 6催化柠檬醛还原51h后产物浓度仅约30 mM，优化后改用单相体系显著提高产物浓度', '以纯度>98%的香叶醛为底物，采用补料策略，12h转化率可达86%，(R)-香茅醛ee为95%', '在15 mmol规模反应中，硫酸铵处理粗酶液含GST-OYE
- 6与GDH，5.75h转化率达95%，(R)-香茅醛分离收率67%，ee为98%，未检测到香茅醇', '含GST-NemA的粗酶液催化橙花醛还原，4h转化率>98%，(S)-香茅醛分离收率69%，ee为99%', '底物累积添加量需控制总底物浓度低于200 mM，乙醇比例低于10%，以维持最佳催化性能']
研究结论
通过合理选择烯烃还原酶和优化反应过程设计，可以简单、可放大地实现克级规模的不对称烯烃还原，为合成化学工具箱增添了实用方法，并已成功推广至其他活化烯烃底物。