ERG9 and COQ1 Disruption Reveals Isoprenoids Biosynthesis is closely Related to Mitochondrial Function in Saccharomyces cerevisiae
- 作者
- Beibei Huang, Jing Guo, Lianna Sun, Wansheng Chen
- 单位
- Department of Pharmacy, Changzheng Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200003, China; California Institute for Quantitative Biosciences, University of California, Berkeley, CA 94720, USA; Department of Pharmacognosy, School of Pharmacy, Second Military Medical University, Shanghai 200433, China
- 杂志
- Integrative Biology（2013）
- DOI
- 10.1039/C3IB40063H
- 所属领域
- 代谢工程 / 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
研究酿酒酵母中异戊二烯生物合成的体内调控机制，特别是ERG9和COQ1基因通过影响代谢通量、底物可用性和细胞能量状态对异戊二烯产物多样性与产量的调控作用，以及线粒体功能与异戊二烯生物合成之间的关联。
研究策略
通过PCR介导的基因敲除构建erg9、coq1单敲除及双敲除的酿酒酵母突变株，利用GC-MS定量检测MVA途径中间代谢物，使用荧光探针和标记技术测定细胞能量状态（ATP、线粒体膜电位、ROS、R6G外排），并导入来自植物的倍半萜合酶（Mg25）和二萜合酶（SmCPS/SmKSL），在不同金属离子和氧条件下分析萜类产物分布。
核心内容
本研究通过PCR介导的基因敲除策略，在酿酒酵母BY4743中构建了ERG9、COQ1单敲除及双敲除突变株，并结合GC-MS代谢物定量、细胞能量状态检测及植物源倍半萜合酶（Mg25）和二萜合酶（SmCPS/SmKSL）的异源表达，系统考察了异戊二烯生物合成与线粒体功能的关联。结果显示，ERG9与COQ1双敲除使FPP和GGPP浓度分别达到0.211和0.113 nM/OD600，较野生型提高约2.4倍和2.8倍；ERG9单敲除虽提升前体水平并产生最多样化的倍半萜产物（如α-muurolol、α-bisabolol），但降低了角鲨烯和麦角固醇含量；而COQ1缺失虽使角鲨烯和麦角固醇分别升至0.548和0.423 nM/OD600，却削弱了萜类合成能力。生理分析表明，突变株均表现出低于野生型的线粒体膜电位，双敲除株ATP水平最低且ROS产生最高，葡萄糖诱导的R6G外排实验显示COQ1敲除株外排能力最强。该研究首次揭示了ERG9和COQ1敲除对酵母异戊二烯代谢及细胞能量状态的全局影响，表明前体可用性提高并不总能增强萜类生产，线粒体能量代谢的激活可能是提升微生物萜类合成效率的关键调控靶点。
创新点
首次系统揭示了ERG9和COQ1基因敲除对酿酒酵母异戊二烯生物合成及全球细胞能量状态的影响；阐明了线粒体功能与异戊二烯生物合成之间的功能关联，提出激活线粒体能量代谢可促进微生物萜类生物合成；结合代谢物分析、生理分析和异源表达，建立了从基因型到表型（萜类产物谱）的综合研究框架。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae BY4743及其突变株 | 甲羟戊酸（MVA）途径 | ERG9 | 角鲨烯合酶（farnesyl-diphosphate farnesyl transferase） | 催化 | 催化FPP转化为角鲨烯，敲除减少甾醇竞争通量，提高异戊二烯前体积累 |
| Saccharomyces cerevisiae BY4743及其突变株 | 甲羟戊酸（MVA）途径/辅酶Q生物合成 | COQ1 | 六异戊烯二磷酸合酶（hexaprenyl diphosphate synthase） | 催化 | 参与辅酶Q生物合成和线粒体呼吸功能，敲除影响能量代谢和萜类合成 |
| Saccharomyces cerevisiae BY4743及其突变株 | 倍半萜生物合成 | Mg25 | β-cubebene合酶 | 催化 | 来自木兰（Magnolia grandiflora），催化FPP生成多种倍半萜 |
| Saccharomyces cerevisiae BY4743及其突变株 | 二萜生物合成 | SmCPS | 柯巴基二磷酸合酶（copalyl diphosphate synthase） | 催化 | 来自丹参（Salvia miltiorrhiza），催化GGPP转化为CPP |
| Saccharomyces cerevisiae BY4743及其突变株 | 二萜生物合成 | SmKSL | 贝壳杉烯合酶类似物（kaurene synthase-like） | 催化 | 来自丹参（Salvia miltiorrhiza），与SmCPS共表达催化CPP生成二萜 |
关键发现
- ERG9和COQ1双敲除使FPP浓度达到0.211 nM/OD600、GGPP为0.113 nM/OD600，分别较野生型（FPP
- 087，GGPP
- 041）提高约2.4倍和2.8倍；ERG9单敲除使GPP、FPP、GGPP分别提高至0.078、0.096、0.061 nM/OD600，且角鲨烯和麦角固醇含量降低（角鲨烯0.121，麦角固醇0.194）；COQ1单敲除使角鲨烯和麦角固醇分别升至0.548和0.423 nM/OD600；葡萄糖诱导的R6G外排实验中，COQ1敲除株外排最强（为无葡萄糖时的3.64倍），双敲除株最弱（2.31倍）；双敲除株细胞内ATP水平最低，野生型最高；突变株线粒体膜电位均低于野生型；双敲除株ROS产生最高，ERG9敲除高于COQ1敲除；倍半萜产物方面，ERG9敲除株产生最多样化的倍半萜（α-muurolol、α-bisabolol等），野生型仅产生globulol，双敲除株产生两种，COQ1敲除株未检测到；二萜产物方面，无额外金属离子时野生型和ERG9敲除株产生thunbergol（ERG9敲除产量更高），添加Mg2+后野生型产生thunbergol和miltiradiene，Mn2+仅产生miltiradiene，Fe2+和单价金属离子无产物。
研究结论
ERG9和COQ1基因敲除显著改变了MVA途径中间代谢物水平和细胞能量状态，前体可用性提高并不总能增强萜类生产，COQ1缺失会削弱萜类合成能力，线粒体功能与异戊二烯生物合成密切相关，激活线粒体能量代谢有望提升微生物萜类代谢工程的效果。