Genome mining and molecular characterization of the biosynthetic gene cluster of a diterpenic meroterpenoid, 15-deoxyoxalicine B, in Penicillium canescens

作者: Junko Yaegashi, Jillian Romsdahl, Yi-Ming Chiang, Clay C. C. Wang
杂志: Chemical Science（2015）
DOI: 10.1039/c5sc01965f
所属领域: 合成生物学
关键词: 15-deoxyoxalicine BPenicillium canescensbiosynthetic gene clustergenome miningmeroterpenoidpolyketide synthase
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解决的核心问题

解析真菌Penicillium canescens中二萜类meroterpenoid化合物15-deoxyoxalicine B的生物合成基因簇及其生物合成途径

研究策略

利用基因组挖掘在P. canescens中发现与pyripyropene A生物合成基因簇同源的基因簇，通过构建ku70Δ、pyrGΔ高效基因靶向菌株，对候选基因进行系列靶向敲除，结合LC-MS分析和中间体/支路产物分离鉴定，阐明生物合成途径

研究路线图

100%

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核心内容

本研究以产二萜类meroterpenoid的真菌Penicillium canescens ATCC 10419为对象，通过基因组挖掘发现与pyripyropene A生物合成基因簇同源的基因簇，并构建ku70Δ与pyrGΔ双突变的高效基因靶向菌株。对候选基因进行系列靶向敲除后，结合LC-MS分析及中间体分离鉴定，首次阐明15-deoxyoxalicine B（1）的生物合成基因簇由12个连续基因olcA–olcL组成。其中olcA编码PKS，与pyripyropene A的pyr2同源性较高（同一性42%），olcC编码GGPP合酶，其敲除使1产量显著降低但未完全消除，提示存在其他GGPP合酶参与。从各敲除株中分离鉴定出7个化合物（2–8），其中predecaturin E（7）和decaturin G（8）为新化合物，分子式分别为C30H39NO4和C30H35NO5。该结果揭示了15-deoxyoxaline B的完整生物合成途径，为理解该类meroterpenoid的分子基础及后续工程改造提供了重要依据。

创新点

['首次鉴定并阐明了oxalicine/decaturin类meroterpenoid的生物合成基因簇', '开发了P. canescens的高效基因靶向系统（ku70和pyrG双突变株）', '分离鉴定出两个新化合物predecaturin E (7)和decaturin G (8)', '提出了15-deoxyoxalicine B的完整生物合成途径']

研究对象（12）

底盘细胞	代谢通路	基因	蛋白	功能	说明
Penicillium canescens ATCC 10419	15-deoxyoxalicine B生物合成	olcA	OlcA	催化	聚酮合酶（PKS），与Pyr2同源，负责pyridinyl-α-pyrone聚酮亚基的组装
Penicillium canescens ATCC 10419	15-deoxyoxalicine B生物合成	olcB	OlcB	催化	细胞色素P450，催化3到1的氧化重排
Penicillium canescens ATCC 10419	15-deoxyoxalicine B生物合成	olcC	OlcC	催化	香叶基香叶基焦磷酸合酶（GGPPS），提供GGPP前体
Penicillium canescens ATCC 10419	15-deoxyoxalicine B生物合成	olcD	OlcD	催化	萜烯环化酶（整合膜蛋白），催化二萜环化
Penicillium canescens ATCC 10419	15-deoxyoxalicine B生物合成	olcE	OlcE	催化	FAD依赖单加氧酶，催化环氧化
Penicillium canescens ATCC 10419	15-deoxyoxalicine B生物合成	olcF	OlcF	催化	短链脱氢酶，催化decaturin F (6)氧化形成29-羟基-27-酮中间体
Penicillium canescens ATCC 10419	15-deoxyoxalicine B生物合成	olcG	OlcG	催化	细胞色素P450，催化predecaturin E (7)的烯丙位氧化，后经螺环化形成decaturin E
Penicillium canescens ATCC 10419	15-deoxyoxalicine B生物合成	olcH	OlcH	催化	异戊烯基转移酶，催化GGPP连接到HPPO
Penicillium canescens ATCC 10419	15-deoxyoxalicine B生物合成	olcI	OlcI	催化	CoA连接酶，催化烟酸形成烟酰辅酶A
Penicillium canescens ATCC 10419	15-deoxyoxalicine B生物合成	olcJ	OlcJ	催化	细胞色素P450，催化decaturin E的C-29羟基化形成decaturin F
Penicillium canescens ATCC 10419	15-deoxyoxalicine B生物合成	olcK	OlcK	催化	2-酮戊二酸-Fe(II)加氧酶，推测是过氧化物酶体酶，催化decaturin C (4)羟基化为decaturin A (3)
Penicillium canescens ATCC 10419	15-deoxyoxalicine B生物合成	olcL	OlcL	转运	MFS超家族转运蛋白，推测将decaturin C转运至过氧化物酶体

关键发现

通过靶向基因敲除，鉴定出12个连续基因（olcA-olcL）组成的基因簇负责15-deoxyoxalicine B (1)的生物合成。olcA编码PKS，与pyripyropene A的pyr2有59%相似性、42%同一性
olcI与pyr1相似性/同一性为71%/58%，olcH与pyr6为68%/52%，olcE与pyr5为74%/60%，olcD与pyr4为57%/41%。olcC（GGPP合酶）敲除后1的产量显著降低但未完全消除，表明存在其他GGPP合酶。从olcB、olcF、olcG、olcJ、olcK、olcL敲除株中分离并鉴定了7个化合物（2-8），其中7（predecaturin E，分子式C30H39NO4）和8（decaturin G，分子式C30H35NO5）为新化合物。1的分子式为C30H32NO6，UV-vis最大吸收为238、269、331 nm。

研究结论

本研究结合基因组挖掘、高效基因靶向和天然产物化学，首次揭示了P. canescens中15-deoxyoxalicine B的生物合成基因簇（12个基因olcA-olcL）及其生物合成途径，为理解该类meroterpenoid的分子基础及后续工程改造提供了依据。