cis or trans with class II diterpene cyclases†
- 杂志
- Organic & Biomolecular Chemistry（2017）
- DOI
- 10.1039/c7ob00510e
- 所属领域
- 合成生物学
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解决的核心问题
验证II类二萜环化酶能否利用非天然底物(Z,Z,Z)-nerylneryl diphosphate (NNPP) 生成顺式-decalin双环产物，以探究萜类前体烯烃构型对环化反应的内在影响。
研究策略
利用模块化代谢工程系统在大肠杆菌中分别合成GGPP和NNPP，筛选12个II类二萜环化酶，对能够利用NNPP的酶进行产物分离与NMR结构鉴定。
核心内容
该研究利用模块化代谢工程系统在大肠杆菌中分别合成天然底物GGPP和非天然底物NNPP，系统考察了12个II类二萜环化酶的底物适应性。结果显示，其中4个酶（AgAS:D621A、SmCPS/KSL1:D501A/D505A、NgCLS和MtHPS）能够接受NNPP并生成顺式双环产物，其中AgAS:D621A对NNPP的转化率约为70%，其余酶低于30%。通过NMR结构鉴定，从AgAS:D621A产物中分离的脱磷酸衍生物被确认为13Z-顺式-顺式-copalol，旋光度为[α]D25=+4（c=3.30, CHCl3）。该产物与从GGPP生成的对应产物结构类似但色谱保留时间不同。研究表明寡异戊二烯前体的烯烃构型（E/Z）并不影响环化级联的内在反应性，II类二萜环化酶对非天然底物具有内在适应性，其底物混杂性为获取立体化学独特的顺式-decalin双环化合物开辟了新途径。
创新点
首次发现II类二萜环化酶能够接受NNPP并产生新型13Z-顺式-decalin双环产物；证实烯烃构型（E/Z）不影响环化级联的内在反应性。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli | 二萜生物合成 | — | AgAS:D621A | 催化 | 来自Abies grandis的II类二萜环化酶突变体，催化GGPP环化为normal CPP；对NNPP的转化率约70%，产物为13Z-cis-syn-CPP（4） |
| Escherichia coli | 二萜生物合成 | — | SmCPS/KSL1:D501A/D505A | 催化 | 来自Selaginella moellendorffii的双功能二萜合酶突变体，失活I类活性，催化GGPP生成endo-CPP；对NNPP推测产物为13Z-cis-syn-endo-CPP（6） |
| Escherichia coli | 二萜生物合成 | — | NgCLS | 催化 | 来自Nicotiana glutinosa的II类二萜环化酶，催化GGPP生成8α-羟基-CPP（7）；对NNPP推测产物为8α-羟基-13Z-cis-syn-CPP（8） |
| Escherichia coli | 二萜生物合成 | — | MtHPS | 催化 | 来自Mycobacterium tuberculosis的II类二萜环化酶，催化GGPP生成halima-5,13E-dienyl diphosphate（9）；对NNPP推测产物为13Z-cis-syn-HPP（10） |
关键发现
- 4个II类二萜环化酶（AgAS:D621A、SmCPS/KSL1:D501A/D505A、NgCLS、MtHPS）能利用NNPP生成单一顺式双环产物
- AgAS:D621A对NNPP转化率约70%，其余<30%
- 从AgAS:D621A产物分离的脱磷酸衍生物（4'）经NMR鉴定为13Z-顺式-顺式-copalol，其旋光度为[α]D25=+4 (c=3.30, CHCl3)
- 产物与从GGPP生成的对应产物虽结构类似但保留时间不同。
研究结论
寡异戊二烯前体对环化级联具有内在适应性，II类二萜环化酶的底物混杂性为获得立体化学独特的顺式-decalin双环化合物提供了新的生物合成途径。