Molecular cloning and characterization of two tropinone reductases in Anisodus acutangulus and enhancement of tropane alkaloid production in AaTRI-transformed hairy roots
- 作者
- Guoyin Kai, Li Li, Yuxin Jiang, Xiangming Yan, Yan Zhang, Xuan Lu, Pan Liao, Jianbo Chen
- 单位
- Laboratory of Plant Biotechnology, College of Life and Environment Sciences, Shanghai Normal University, 100 Guilin Road, Shanghai 200234, People's Republic of China; Department of Basic Medicine, Wannan Medical College, 10 Weiliu Road, Wuhu 241002, People's Republic of China
- 杂志
- Biochemical Journal（2009）
- DOI
- 10.1042/BA20090171
- 所属领域
- 植物代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
克隆并表征了中华山莨菪（Anisodus acutangulus）中两个托品酮还原酶TRI和TRII，并验证过表达TRI能有效提高托烷生物碱（天仙子胺和东莨菪碱）的产量。
研究策略
采用RACE技术克隆TRI和TRII全长cDNA，进行序列比对、系统发育和表达模式分析；构建TRI过表达载体，通过农杆菌介导转化获得转基因毛状根，并用HPLC测定生物碱含量。
核心内容
该研究从中华山莨菪中克隆并表征了两个托品酮还原酶基因AaTRI和AaTRII。序列分析显示AaTRI cDNA全长1188 bp，编码273个氨基酸，而AaTRII cDNA全长1116 bp，编码260个氨基酸，两者氨基酸一致性仅为60.8%。表达模式分析表明两个基因在所有组织中均有表达，但TRI转录水平显著低于TRII，且茉莉酸甲酯对TRII的诱导作用更为强烈。通过农杆菌介导将AaTRI过表达载体转入中华山莨菪获得转基因毛状根，HPLC检测发现五个TRI转化系的天仙子胺含量平均达5.43 mg/g干重，为对照组的1.87倍，其中122系达到9.11 mg/g干重，是对照的3.14倍；东莨菪碱含量平均提高8倍，119系提高至对照的17倍。研究表明AaTRI是提高托烷生物碱产量的理想基因工程靶点，单基因过表达即能显著促进天仙子胺和东莨菪碱的积累，未来与AaH6H等基因共表达可能进一步提升东莨菪碱产量，为药用植物代谢工程改良提供了新思路。
创新点
首次从中华山莨菪中克隆并鉴定TRI和TRII基因；证明了AaTRI单基因转化可显著增加托烷生物碱产量，为代谢工程改良药用植物提供了新靶点。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Anisodus acutangulus | 托烷生物碱生物合成通路 | AaTRI | 托品酮还原酶I（tropinone reductase I） | 催化 | 催化托品酮还原为托品（3α-羟基托烷），是hyoscyamine合成途径的关键酶 |
| Anisodus acutangulus | 托烷生物碱生物合成通路 | AaTRII | 托品酮还原酶II（tropinone reductase II） | 催化 | 催化托品酮还原为假托品（3β-羟基托烷），导向calystegine合成 |
| Anisodus acutangulus 转基因毛状根（由农杆菌介导转化获得） | 托烷生物碱生物合成通路 | AaTRI（过表达） | 托品酮还原酶I | 催化 | 单基因过表达使hyoscyamine平均提高1.87倍，scopolamine平均提高8倍 |
| Anisodus acutangulus | 托烷生物碱生物合成通路 | AaH6H | 天仙子胺6β-羟化酶（hyoscyamine 6β-hydroxylase） | 催化 | 催化hyoscyamine转化为scopolamine，MeJA处理在根和叶中表达增强 |
| Anisodus acutangulus | 托烷生物碱生物合成通路 | AaPMT | 腐胺N-甲基转移酶（putrescine N-methyltransferase） | 催化 | 托烷生物碱生物合成的第一个关键酶，MeJA处理后表达增强 |
关键发现
- AaTRI cDNA全长1188 bp，编码273个氨基酸（pI
- 45，分子量约29.5 kDa）；AaTRII cDNA全长1116 bp，编码260个氨基酸（pI
- 35，分子量约28.3 kDa）。AaTRI与HnTRI、DsTRI、StTRI、CsTRI氨基酸一致性分别为90%、87%、86%、57%；AaTRII与HnTRII、StTRII、DsTRII一致性分别为97%、97%、93%；AaTRI与AaTRII之间一致性仅60.8%。表达分析显示两者在所有组织中均表达，但TRI转录水平显著低于TRII；MeJA强烈诱导TRII表达，对TRI诱导较弱。转基因毛状根中，对照组的hyoscyamine含量为2.90 mg/g干重，scopolamine为0.01 mg/g干重；五个TRI转化系（117、119、120、122、138）的hyoscyamine含量分别为4.60、4.29、5.79、9.11、3.35 mg/g干重，平均5.43 mg/g干重，其中122系为对照的3.14倍；scopolamine含量分别为0.02、0.17、0.02、0.10、0.08 mg/g干重，平均0.08 mg/g干重，其中119系为对照的17倍。总体上，TRI转化毛状根中hyoscyamine平均提高1.87倍，scopolamine平均提高8倍。
研究结论
AaTRI是提高中华山莨菪中托烷生物碱产量的理想基因工程靶点，过表达AaTRI可显著增加hyoscyamine和scopolamine积累，未来与AaH6H等基因共过表达可能进一步提高东莨菪碱产量。