Engineered Rhodobacter capsulatus as a Phototrophic Platform Organism for the Synthesis of Plant Sesquiterpenoids
- 作者
- Katrin Troost, Anita Loeschcke, Fabienne Hilgers, Armagan Yakup Özgür, Tim Moritz Weber, Beatrix Santiago-Schübel, Vera Svensson, Jennifer Hage-Hülsmann, Samer S. Habash, Florian M. W. Grundler, A. Sylvia S. Schleker, Karl-Erich Jaeger, Thomas Drepper
- 单位
- Institute of Molecular Enzyme Technology, Heinrich Heine University Düsseldorf, Düsseldorf, Germany, Forschungszentrum Julich GmbH, Julich, Germany; Central Institute for Engineering, Electronics and Analytics ZEA-3, Analytics, Forschungszentrum Julich GmbH, Julich, Germany; INRES-Molecular Phytomedicine, Rheinisch Friedrich-Wilhelm University of Bonn, Bonn, Germany; Institute of Bio- and Geosciences IBG-1, Biotechnology, Forschungszentrum Julich GmbH, Julich, Germany
- 杂志
- Frontiers in Microbiology（2019）
- DOI
- 10.3389/fmicb.2019.01998
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
如何利用光合紫色细菌Rhodobacter capsulatus作为平台，在光合营养条件下实现植物倍半萜（广藿香醇和朱栾倍半萜）的异源合成，并通过模块化前体供给工程提高产量。
研究策略
构建受P_nif启动子严格调控的表达载体pRhon5Hi-2，异源表达植物倍半萜合酶（PcPS、CsVS、CnVS），模块化共表达DXP途径关键基因（dxs、idi）、FPP合酶基因ispA以及来自Paracoccus zeaxanthinifaciens的MVA基因簇，并构建染色体整合MVA途径的工程菌株SB1003-MVA，在光养厌氧条件下评估不同组合的产物积累。
核心内容
该研究以光合紫色细菌荚膜红杆菌为底盘，构建了光养条件下合成植物倍半萜的模块化平台。作者开发了受P_nif启动子严格调控的宽宿主表达载体pRhon5Hi-2，异源表达广藿香醇合酶及两种朱栾倍半萜合酶，并通过模块化共表达FPP合酶基因ispA、DXP途径关键基因dxs/idi以及染色体整合的MVA途径来优化前体供给。在野生型菌株中单独表达PcPS仅产生微量产物，共表达ispA、dxs或idi使产量提高9至15倍，引入MVA基因簇提高26倍。在整合MVA途径的工程菌株SB1003-MVA中，最佳组合（染色体MVA加质粒ispA-dxs-idi）使广藿香醇产量提高126倍，达到24±2 mg/L；朱栾倍半萜合成中，CnVS活性高于CsVS，共表达ispA使产量提高255倍，达18±3 mg/L。值得注意的是，将所有前体基因在质粒上共表达反而导致产物积累丧失，提示存在反馈抑制。该工作证明荚膜红杆菌可作为可持续倍半萜生产的光养平台，且前体供给模块需针对不同萜烯合酶进行适配优化。
创新点
1. 首次在R. capsulatus中建立基于P_nif启动子的模块化倍半萜合成体系；2. 通过染色体整合MVA途径与质粒共表达ispA/dxs/idi的组合，实现广藿香醇最高126倍增产；3. 发现不同倍半萜合酶需匹配不同的前体基因组合，证明前体供给模块需针对目标酶进行适配；4. 开发了宽宿主范围、严格调控的表达载体pRhon5Hi-2。
研究对象（10）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Rhodobacter capsulatus SB1003 | 萜类生物合成 | — | — | 区室化 | 光合紫色非硫细菌，具有胞内细胞膜系统（ICM），为疏水萜类产物提供储存空间 |
| Rhodobacter capsulatus SB1003-MVA | MVA途径 | — | — | 区室化 | 在nifHDK位点染色体整合了来自Paracoccus zeaxanthinifaciens的MVA基因簇，受P_nif控制 |
| Rhodobacter capsulatus SB1003 | 倍半萜生物合成 | PcPS | patchoulol synthase (PcPS) | 催化 | 来自Pogostemon cablin，催化FPP转化为广藿香醇 |
| Rhodobacter capsulatus SB1003 | 倍半萜生物合成 | CsVS | valencene synthase (CsVS) | 催化 | 来自Citrus sinensis，催化FPP转化为valencene，活性较低 |
| Rhodobacter capsulatus SB1003 | 倍半萜生物合成 | CnVS | valencene synthase (CnVS) | 催化 | 来自Callitropsis nootkatensis，催化FPP转化为valencene，活性显著高于CsVS |
| Rhodobacter capsulatus SB1003 | 萜类前体（FPP）生物合成 | ispA | farnesyl pyrophosphate synthase (IspA) | 催化 | 来自R. capsulatus，催化IPP/DMAPP缩合生成FPP |
| Rhodobacter capsulatus SB1003 | DXP途径 | dxs | 1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase (DxS) | 催化 | 来自Rhodobacter sphaeroides，DXP途径限速酶 |
| Rhodobacter capsulatus SB1003 | DXP/MVA途径 | idi | isopentenyl pyrophosphate isomerase (Idi) | 催化 | 来自Rhodobacter sphaeroides，催化IPP与DMAPP互变 |
| Rhodobacter capsulatus SB1003 | MVA途径 | mvaA-idi-hsc-mvk-pmk-mvd | MVA pathway enzymes | 催化 | 来自Paracoccus zeaxanthinifaciens，编码乙酰乙酰-CoA转化至IPP/DMAPP的完整MVA途径酶 |
| Rhodobacter capsulatus SB1003 | 基因表达调控 | P_nif | — | 调控 | 来自R. capsulatus nifHDK启动子，受铵和氧严格抑制，用于光养条件下诱导异源基因表达 |
关键发现
- 在R. capsulatus野生型中单独表达PcPS仅产生微量广藿香醇
- 共表达ispA、dxs或idi分别使产量提高9-15倍，共表达MVA基因簇提高26倍。在SB1003-MVA菌株（染色体整合MVA途径）中表达PcPS产量提高20倍
- 进一步共表达ispA-dxs和ispA-dxs-idi分别提高93倍和115倍
- 最佳组合（染色体MVA+质粒ispA-dxs-idi）共提高126倍，最终广藿香醇产量达24±2 mg/L（120 h）。对于CsVS，在SB1003-MVA中共表达ispA、dxs、idi使valencene产量提高36倍
- 而CnVS活性更高，野生型中产量即比CsVS高16倍，在SB1003-MVA中共表达ispA最高使valencene产量提高255倍，最终valencene产量为18±3 mg/L（48 h）。所有前体模块基因（ispA-dxs-idi-MVA）的质粒共表达在广藿香醇和valencene合成中均导致产物积累丧失或显著降低，提示存在反馈抑制效应。
研究结论
R. capsulatus可作为光合营养条件下合成倍半萜的替代平台，通过模块化共表达FPP生物合成基因可适应不同植物萜烯合酶的前体需求，实现产物形成优化。该工作为可持续倍半萜生产提供了新底盘，并具有农业植物保护和医学诊疗应用的潜力。