Verification of TRI3 Acetylation of Trichodermol to Trichodermin in the Plant Endophyte Trichoderma taxi
- 作者
- Haijiang Chen, Lijuan Mao, Nan Zhao, Chenyang Xia, Jian Liu, Christian P. Kubicek, Wenmeng Wu, Su Xu, Chulong Zhang
- 单位
- 贵阳学院食品与制药工程学院；浙江大学生物技术研究所；中国烟草贵州工业有限责任公司技术中心；浙江大学农业生物学与环境科学分析中心；维也纳工业大学生物化学技术研究所微生物学组
- 杂志
- Frontiers in Microbiology（2021）
- DOI
- 10.3389/fmicb.2021.731425
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
验证植物内生真菌 Trichoderma taxi 中 TRI3 基因是否编码乙酰转移酶，催化 trichodermol 的 C-4 位乙酰化生成 trichodermin。
研究策略
通过基因组挖掘鉴定 TRI 基因簇，利用同源重组敲除 TtTRI3 并回补验证，在大肠杆菌中异源表达并纯化 TRI3 蛋白进行体外酶活分析，同时利用 qRT-PCR 检测 TRI3 缺失对相关 TRI 基因表达的影响。
核心内容
本研究以植物内生真菌 Trichoderma taxi 为对象，通过基因组挖掘鉴定到一个约42.5 kb的TRI基因簇，含TRI3、TRI4、TRI6、TRI10、TRI11、TRI12、TRI14等基因，其中TRI5不在簇内。采用同源重组策略敲除TtTRI3并回补验证，同时在大肠杆菌中异源表达纯化TRI3蛋白进行体外酶活分析，结合qRT-PCR检测基因表达变化。结果显示，TtTRI3与近缘种TRI3氨基酸序列同一性达83%，敲除后trichodermin产量显著降低，回补后产量恢复甚至超过野生型；体外实验证明His标记TRI3蛋白（纯度>70%，约60 kDa）能在乙酰-CoA存在下将trichodermol转化为trichodermin。此外，TRI3缺失导致TRI4、TRI11、TRI12表达下调超50%，TRI6下调约30%；野生型发酵液10%体积比可强烈抑制立枯丝核菌，而敲除株发酵液增至20%也无抑制作用。研究首次直接证明了TRI3乙酰转移酶的体内外功能，阐明trichodermin生物合成必需步骤及其抗真菌活性来源，并提示该通路存在代谢物反馈调控机制。
创新点
首次直接证明 TRI3 在体外催化 trichodermol 乙酰化为 trichodermin；首次在 Trichoderma taxi 中验证了 TRI3 的体内功能；发现 TRI3 缺失引起其他 TRI 结构基因表达下调，提示存在代谢物反馈调控。
研究对象（7）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Trichoderma taxi | trichodermin生物合成途径 | TRI3 | TRI3乙酰转移酶 | 催化 | 催化 trichodermol 的 C-4 位乙酰化生成 trichodermin |
| Trichoderma taxi | trichodermin生物合成途径 | TRI4 | TRI4细胞色素P450单加氧酶 | 催化 | 氧化 trichodiene 形成 isotrichodiol |
| Trichoderma taxi | trichodermin生物合成途径 | TRI11 | TRI11细胞色素P450羟化酶 | 催化 | 催化 EPT 的 C-4 位羟基化生成 trichodermol |
| Trichoderma taxi | trichodermin生物合成途径 | TRI12 | TRI12单端孢霉烯外排泵 | 转运 | 负责 trichothecene 的胞外运输 |
| Trichoderma taxi | trichodermin生物合成途径 | TRI6 | TRI6 C2H2锌指转录因子 | 调控 | 调控 TRI 基因的表达 |
| Trichoderma taxi | trichodermin生物合成途径 | TRI10 | TRI10转录因子 | 调控 | 调控 TRI 基因的表达 |
| Escherichia coli | 异源表达 | TRI3 | His标签TRI3蛋白 | 催化 | 用于体外酶活验证，证明其乙酰转移酶活性 |
关键发现
- ['在 T. taxi 中鉴定到一个约 42.5 kb 的 TRI 基因簇，包含 TRI3、TRI4、TRI6、TRI10、TRI11、TRI12、TRI14，排列顺序与 T. arundinaceum 和 T. brevicompactum 一致，且 TRI5 不在簇内。', 'TtTRI3 蛋白与 T. arundinaceum 和 T. brevicompactum 的 TRI3 氨基酸序列同一性均为 83%，与 Fusarium sporotrichioides 的同一性为 48%。', '敲除 TtTRI3 后，trichodermin 产量显著降低，但 trichodermol 水平未明显累积
- 回补 TRI3 后 trichodermin 产量恢复，且高于野生型。', '体外酶活实验证明，His 标记的 TRI3 蛋白（纯度 >70%，分子量约 60 kDa）在乙酰-CoA 存在下能将 trichodermol 转化为 trichodermin。', 'TtTRI3 敲除导致 TtTRI4、TtTRI11、TtTRI12 的表达量下调超过 50%，TtTRI6 下调约 30%，TtTRI10 表达不受影响。', '10%（v/v）野生型发酵液强烈抑制立枯丝核菌生长，20% 完全抑制
- 而 TRI3 敲除株的发酵液即使加到 20% 也无抑制作用。']
研究结论
Trichoderma taxi 中的 TRI3 编码乙酰转移酶，利用乙酰-CoA 催化 trichodermol 的 C-4 羟基乙酰化生成 trichodermin，这是 trichodermin 生物合成中的必需步骤；trichodermin 赋予 T. taxi 对立枯丝核菌的抑制活性；TRI3 缺失导致 TRI 结构基因表达下调，表明该通路存在代谢物反馈调控。