Cell-free studies of monoterpene and sesquiterpene biosynthesis

作者: David E. Cane
单位: Department of Chemistry, Brown University, Providence, RI 02912, U.S.A.
杂志: Biochemical Society Transactions（1983）
DOI: 10.1042/bst0110510
所属领域: 天然产物生物合成
关键词: allylic pyrophosphatebornyl pyrophosphatecell-free biosynthesiscyclizationisotope labellingpentaleneneterpenoids
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解决的核心问题

研究单萜和倍半萜生物合成中烯丙基焦磷酸经环化酶催化的重排与环化机制，解析关键酶促反应的立体化学和电子过程。

研究策略

利用来自链霉菌和高等植物的无细胞酶体系，结合放射性同位素（3H、14C）和稳定同位素（18O）标记技术，追踪底物（geranyl pyrophosphate和farnesyl pyrophosphate）在环化酶作用下的代谢转化。

研究路线图

100%

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核心内容

该研究利用来自链霉菌UC5319及高等植物的无细胞酶体系，结合放射性同位素（3H、14C）与稳定同位素（18O）标记，系统解析了单萜和倍半萜环化酶催化的重排与环化机制。实验证实pentalenene合成酶能以farnesyl pyrophosphate为底物直接环化生成pentalenene，反应速率约0.03 mmol/h每毫克蛋白，且该酶在4℃下4小时活性损失50%；通过双标记底物降解分析发现产物中3H/14C原子比为0.9:2，表明环化过程中损失一半3H，而使用[9-3H2]标记底物时内部质子返回现象得到证实。单萜研究中，[1-18O]geranyl pyrophosphate经(+)-bornyl pyrophosphate合成酶转化后，产物含52.4%的18O，校正后为72%，远高于位置交换预期的22.6%，证明焦磷酸基团在环化过程中不发生位置交换。结果表明这些环化酶在单一活性位点介导连续环化且不释放中间体，深化了对萜类生物合成立体化学控制的理解。

创新点

首次在无细胞体系中证明pentalenene合成酶可催化farnesyl pyrophosphate直接环化为pentalenene，且通过双标记实验和18O示踪揭示了环化过程中单一酶活性位点介导两次环化以及焦磷酸基团在原位保持不交换的独特机制。

研究对象（3）

底盘细胞	代谢通路	基因	蛋白	功能	说明
Streptomyces UC5319	倍半萜生物合成	—	pentalenene synthetase	催化	催化farnesyl pyrophosphate环化生成pentalenene，速率约0.03 mmol/h per mg蛋白，活性不稳定
Salvia officinalis	单萜生物合成	—	(+)-bornyl pyrophosphate synthetase	催化	催化geranyl pyrophosphate立体选择性环化生成(+)-bornyl pyrophosphate
Tanacetum vulgare	单萜生物合成	—	(-)-bornyl pyrophosphate synthetase	催化	催化geranyl pyrophosphate生成(-)-bornyl pyrophosphate，18O标记显示100%保留在C-2

关键发现

从Streptomyces UC5319制备的无细胞提取物催化[8-3H2,12,13-14C]farnesyl pyrophosphate生成pentalenene，速率约为0.03 mmol/h per mg蛋白
该酶活性在4℃下4小时损失50%。降解实验显示pentalenene中3H/14C原子比为0.9:2（损失一半3H）。使用[9-3H2,12,13-14C]底物时，得到的二醇A的3H/14C原子比为1.7:1，交换后为0.8:1，说明存在内部质子返回。在单萜研究中，[1-18O]geranyl pyrophosphate（67.9 atom% 18O）经(+)-bornyl pyrophosphate合成酶转化后，产物(+)-bornyl benzoate含52.4±1.4% 18O，校正后为72±3%
若发生位置交换则应为22.6%，表明无位置同位素交换。(-)-bornyl pyrophosphate合成酶（来自Tanacetum vulgare）的平行实验显示约100% 18O保留在C-2。此外，trichodiene和bisabolene的形成均保留C-1的两个氢。

研究结论

无细胞酶体系为研究萜类环化酶提供了有力工具。实验证明pentalenene合成酶催化两步环化且不释放中间体，而单萜环化酶中焦磷酸基团在环化过程中被严格限制在原位，这些结果深化了对萜类生物合成机理的理解。