Expression, characterization and engineered specificity of rat epididymal retinoic acid-binding protein
- 作者
- Manickavasagam SUNDARAM, Asipu SIVAPRASADARAO, Daan M. F. VAN AALTEN, John B. C. FINDLAY
- 单位
- School of Biochemistry and Molecular Biology, University of Leeds, Leeds LS2 9JT, U.K.; Department of Pharmacology, University of Leeds, Leeds LS2 9JT, U.K.
- 杂志
- Biochemical Journal（1998）
- DOI
- 10.1042/bj3340155
- 所属领域
- 蛋白质工程
- 关键词
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解决的核心问题
确定大鼠附睾视黄酸结合蛋白(ERABP)配体特异性的结构决定因素，并尝试通过工程改造改变其配体结合特异性。
研究策略
将ERABP及其双突变体在E. coli中表达为Strep标签融合蛋白，纯化后通过荧光滴定法测定与不同维A酸类配体的结合亲和力；基于晶体结构指导的定点突变来改造结合口袋入口处的带电残基。
研究路线图
核心内容
本研究在大肠杆菌中表达了野生型大鼠附睾视黄酸结合蛋白（ERABP）及其基于晶体结构设计的双突变体Glu63Ile/Arg80Ile，并通过荧光滴定法测定其与维A酸类配体的结合亲和力。结果显示，野生型ERABP仅特异性结合视黄酸，表观解离常数Kd为0.9±0.2×10^-6 M；而双突变体则表现出广谱结合特性，可同时结合视黄醇（Kd=2.2±0.3×10^-6 M）、视黄醛（Kd=0.28±0.07×10^-6 M）和视黄酸（Kd=1.6±0.2×10^-6 M）。重组蛋白纯化产量约100 μg/L培养物，回收率约30%，分子量为21 kDa。该结果直接证明ERABP结合口袋入口处的带电残基Arg-80和Glu-63是决定其专一结合视黄酸的关键结构因素，将它们突变为异亮氨酸后，蛋白转变为广谱维A酸结合蛋白。这一发现表明脂笼蛋白家族的配体特异性可通过定点突变加以工程改造，为设计具有新型配体结合特性的蛋白质提供了重要依据。
创新点
首次通过双突变将ERABP从单一视黄酸结合蛋白改造为广谱维A酸结合蛋白，直接证明结合口袋入口处的带电残基网络是决定配体特异性的关键。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli TOPP2 | 视黄酸结合与转运 | ERABP | 附睾视黄酸结合蛋白 (ERABP) | 转运 | 野生型，与Strep标签融合表达于周质，只结合视黄酸 |
| Escherichia coli TOPP2 | 视黄酸结合与转运 | ERABP (双突变体) | ERABP Glu63Ile/Arg80Ile | 转运 | 通过定点突变获得，可结合视黄醇、视黄酸和视黄醛 |
| Escherichia coli | 视黄酸结合与转运 | RBP | 血清视黄醇结合蛋白 (RBP) | 转运 | 用于结构对比的天然广谱维A酸结合蛋白 |
关键发现
- 野生型ERABP仅结合视黄酸，表观解离常数Kd为0.9±0.2×10^-6 M
- 双突变体(Glu63Ile/Arg80Ile)可同时结合视黄醇(Kd=2.2±0.3×10^-6 M)、视黄醛(Kd=0.28±0.07×10^-6 M)和视黄酸(Kd=1.6±0.2×10^-6 M)。纯化蛋白产量约100 μg/L培养物，回收率约30%，重组蛋白分子量21 kDa。
研究结论
ERABP结合口袋入口处的两个带电残基Arg-80和Glu-63是决定其专一结合视黄酸的关键因素；将它们突变为异亮氨酸后，ERABP转变为广谱维A酸结合蛋白，表明脂笼蛋白的配体特异性可以通过工程改造加以改变，为设计具有新型配体结合特性的蛋白质提供了依据。