Stress induction of the Bacillus subtilis clpP gene encoding a homologue of the proteolytic component of the Clp protease and the involvement of ClpP and ClpX in stress tolerance
- 作者
- Ulf Gerth, Elke Kruger, Isabelle Derre, Tarek Msadek, Michael Hecker
- 单位
- Institut fur Mikrobiologie und Molekularbiologie, Ernst-Moritz-Arndt-Universitat, F.-L.-Jahn-Straße 15, 17487 Greifswald, Germany; Unite de Biochimie Microbienne, URA 1300 du Centre National de la Recherche Scientifique, Institut Pasteur, 25 rue du Dr Roux, 75724 Paris Cedex 15, France
- 杂志
- Molecular Microbiology（1998）
- DOI
- 10.1046/j.1365-2958.1998.00840.x
- 所属领域
- 微生物学
- 关键词
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解决的核心问题
解析枯草芽孢杆菌clpP基因的克隆、序列及其胁迫诱导表达调控机制，并阐明ClpP和ClpX在应激耐受中的生理功能。
研究策略
通过克隆测序、转录起始位点定位、启动子-报告基因融合、基因敲除突变体构建、表型分析及双向蛋白电泳比较，系统研究clpP的调控机制及ClpP/ClpX的生理功能。
研究路线图
核心内容
该研究克隆并鉴定了枯草芽孢杆菌clpP基因，系统解析了其胁迫诱导的表达调控机制及ClpP与ClpX在应激耐受中的生理功能。研究者通过启动子-报告基因融合、转录起始位点定位和基因敲除等手段发现，clpP受σA和σB双启动子调控，其中σA依赖启动子贡献约80%的热激诱导活性，σB启动子贡献约24%，表明σA在热激响应中起主导作用。热激48°C六分钟后clpP mRNA水平升高近30倍，盐、乙醇和嘌呤霉素处理分别诱导约10倍和20倍。clpP和clpX突变体均呈现链状延长形态，在盐、乙醇及50°C热激下生长严重受损，且clpX突变体孢子形成率降至3.5%（野生型65%），稳定期存活率仅4.0×10^6 cfu/ml，远低于野生型的3.0×10^10 cfu/ml。双向电泳鉴定出GroEL、PpiB等潜在ClpXP底物蛋白。该工作揭示了clpP属于III类热激基因的双启动子亚群，并证明ClpP/ClpX蛋白酶系统对于细胞形态维持、应激生存、孢子形成及蛋白质质量控制均不可或缺。
创新点
发现clpP受σA和σB双启动子调控，属于III类热激基因的双启动子亚群；证明σA依赖启动子是热激诱导的主要驱动者；首次鉴定多个潜在的ClpXP蛋白酶底物。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Bacillus subtilis | 热激响应/一般应激响应 | clpP | ClpP | 催化 | Clp蛋白酶的蛋白水解组分，催化异常蛋白降解，含丝氨酸蛋白酶催化三联体(Ser-98, His-123, Asp-172) |
| Bacillus subtilis | 热激响应/一般应激响应 | clpX | ClpX | 能量供给 | Clp蛋白酶的调控性ATP酶亚基，提供能量并参与底物识别和去折叠 |
| Bacillus subtilis | 热激响应/一般应激响应 | sigA | σA因子 | 调控 | RNA聚合酶σA因子，介导clpP的主要胁迫诱导转录 |
| Bacillus subtilis | 热激响应/一般应激响应 | sigB | σB因子 | 调控 | 一般应激响应σ因子，参与clpP的次级诱导；sigB突变体中clpP仍可经σA启动子诱导 |
关键发现
- 热激(48°C)6分钟后clpP mRNA水平增加近30倍
- 4% NaCl和5%乙醇处理后增加约10倍，20 μg/ml嘌呤霉素处理后增加约20倍。clpP基因编码197个氨基酸的蛋白，分子量约21682 Da，等电点5.19，ClpP蛋白与大肠杆菌ClpP的氨基酸序列一致性为69%。primer extension鉴定出两个转录起始位点，分别由σA和σB依赖启动子控制，σA启动子对热激诱导贡献约80%的BgaB活性，σB启动子贡献约24%。clpP和clpX突变体均产生链状延长细胞，在盐、乙醇和50°C热激条件下生长严重受损
- clpX突变体无法在50°C生长，孢子形成率仅3.5%（野生型为65%），稳定期存活率4.0×10^6 cfu/ml（野生型3.0×10^10 cfu/ml）。双向电泳发现GroEL、PpiB、PykA、SucD、YhfP、YqkF、YugJ和YvyD等蛋白在clpP和clpX突变体中积累，可能为ClpXP蛋白酶底物。
研究结论
B. subtilis clpP属于III类热激基因，受σA和σB双启动子控制，σA启动子在热激诱导中起主要作用。ClpP和ClpX是应激耐受、正常细胞形态、稳定期生存和孢子形成所必需，并可能通过降解特定底物参与蛋白质质量控制。