Functional assembly of the foreign carotenoid lycopene into the photosynthetic apparatus of Rhodobacter sphaeroides, achieved by replacement of the native 3-step phytoene desaturase with its 4-step counterpart from Erwinia herbicola
- 作者
- Guillermo Garcia-Asua, Richard J. Cogdell, C. Neil Hunter
- 单位
- Department of Molecular Biology and Biotechnology, University of Sheffield, Sheffield, UK; Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Glasgow, Glasgow, UK
- 杂志
- Molecular Microbiology（2002）
- DOI
- 10.1046/j.1365-2958.2002.02871.x
- 所属领域
- 代谢工程 / 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
如何通过替换八氢番茄红素脱氢酶（phytoene desaturase）将外源类胡萝卜素番茄红素功能性地组装入光合细菌 Rhodobacter sphaeroides 的光合装置中。
研究策略
用 Erwinia herbicola 的 4 步八氢番茄红素脱氢酶基因 crtI 替换 Rb. sphaeroides 的天然 3 步酶，并构建 crtIC 双突变体（DM2）阻断下游修饰途径，使番茄红素积累并组装到光合膜复合物中。
核心内容
研究者用来自Erwinia herbicola的四步八氢番茄红素脱氢酶基因crtI替换了Rhodobacter sphaeroides中天然的三步酶，并同时敲除crtC羟化酶基因构建双突变体DM2，从而将内源类胡萝卜素合成途径重编程为以番茄红素为主要终产物。在crtIC双突变体DM2[pERWI2]中，番茄红素占总类胡萝卜素的93%，神经孢烯与八氢番茄红素仅分别占3%和4%；而在仅含crtC突变的G1c[pERWI2]中番茄红素占83%。纯化出的含番茄红素LH2捕光复合物仍保持典型的800和850 nm吸收峰，类胡萝卜素特征吸收峰较天然红移约20 nm；荧光激发光谱显示番茄红素向细菌叶绿素的能量传递效率为54%，与含11个共轭双键类胡萝卜素的天然LH2复合物（56%）相当，说明外源番茄红素能够取代内源类胡萝卜素进入光合膜复合物并有效参与光能传递。DM2[pERWI2]中每细胞类胡萝卜素含量为野生型的60%，细菌叶绿素为66%。该工作首次证明仅通过单一酶替换即可在紫色光合细菌中构建以番茄红素为主的类胡萝卜素途径，且外源类胡萝卜素可功能性组装入光合装置，为光合复合物结构与功能研究及类胡萝卜素工程改造提供了可行策略。
创新点
首次通过单基因替换在 Rb. sphaeroides 中实现以番茄红素为主要类胡萝卜素的途径重编程；证明外源番茄红素能取代天然类胡萝卜素进入 LH2 复合物并承担光能传递功能。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Rhodobacter sphaeroides | 类胡萝卜素生物合成 | crtI | 八氢番茄红素脱氢酶（CrtI） | 催化 | 天然 3 步酶，被替换为 E. herbicola 的 4 步酶 |
| Erwinia herbicola | 类胡萝卜素生物合成 | crtI | 四步八氢番茄红素脱氢酶（CrtI） | 催化 | 外源 4 步脱氢酶，在 Rb. sphaeroides 中表达 |
| Rhodobacter sphaeroides | 类胡萝卜素生物合成 | crtC | CrtC 羟化酶 | 催化 | 被突变或敲除以阻止番茄红素进一步代谢 |
关键发现
- 在 crtC 突变体 G1c[pERWI2] 中，番茄红素占总类胡萝卜素的 83%
- 在 crtIC 双突变体 DM2[pERWI2] 中，番茄红素占 93%，神经孢烯 3%，八氢番茄红素 4%。TC71[pERWI2]（crtI 突变体）中约一半流量流向 spirilloxanthin 途径，产生 48% 的 2,2'-diketospirilloxanthin。在 crtC 背景下，天然 3 步酶也能产生 13% 的番茄红素（DM2[pHLKPD1]）。纯化的含番茄红素 LH2 复合物表现出典型的 800 和 850 nm 吸收峰，类胡萝卜素吸收峰红移约 20 nm
- 荧光激发光谱显示番茄红素向细菌叶绿素的能量传递效率为 54%，与含 11 个共轭双键类胡萝卜素的其他 LH2 复合物（如 56%）相当。DM2[pERWI2] 中每细胞类胡萝卜素含量为野生型的 60%，BChl 为 66%。
研究结论
通过将天然 3 步八氢番茄红素脱氢酶替换为来自 Erwinia herbicola 的 4 步酶并阻断 CrtC 羟化酶，可在 Rhodobacter sphaeroides 中构建以番茄红素为主要类胡萝卜素的途径；番茄红素能功能性地组装到 LH2 复合物中，并作为能量供体高效传递光能给细菌叶绿素，证明该外源类胡萝卜素可参与光合复合物的组装和功能。