Molecular cloning of geranyl diphosphate synthase and compartmentation of monoterpene synthesis in plant cells
- 作者
- Florence Bouvier, Claude Suire, Alain d'Harlinque, Ralph A. Backhaus, Bilal Camara
- 单位
- Institut de Biologie Moléculaire des Plantes du Centre National de la Recherche Scientifique and Université Louis Pasteur, 12 rue du Général Zimmer, 67084 Strasbourg, France; Institut de Biochimie Cellulaire du Centre National de la Recherche Scientifique, 1 rue Camille Saint Saëns, 33077 Bordeaux, France; Laboratoire de Biochimie et Pathologie Végétale, Université Pierre et Marie Curie, 75252 Paris, France; Department of Botany, Arizona State University, Tempe, AZ 85287-1601, USA
- 杂志
- The Plant Journal（2000）
- DOI
- 10.1046/j.1365-313x.2000.00875.x
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
单萜生物合成的前体香叶基二磷酸(GPP)合酶在植物中的分子身份及其在细胞内的区室化分布长期不清楚；以往认为单萜仅在特化分泌结构中合成，对光合薄壁细胞中是否也能进行单萜合成缺乏认识。
研究策略
采用保守氨基酸基序设计简并引物，通过PCR从拟南芥中克隆GPPS cDNA；利用大肠杆菌异源表达、免疫亲和纯化和TLC/HPLC分析鉴定重组酶活性；制备GPPS、单萜合酶、DXS等特异抗体进行免疫组织化学定位；结合叶绿体蛋白导入实验和离体叶绿体/免疫纯化酶活实验验证质体定位与GPP合成。
核心内容
该研究从拟南芥中克隆并功能鉴定了编码香叶基二磷酸合酶（GPPS）的cDNA，并系统探讨了单萜前体GPP在植物细胞内的区室化合成分布。作者利用保守基序设计简并引物PCR扩增获得全长cDNA，其开放阅读框编码422个氨基酸，与牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合酶及法尼基二磷酸合酶的一致性分别为28.7%和24.2%。体外转录翻译产生约45 kDa前体和36–38 kDa成熟多肽，叶绿体蛋白导入实验证实仅前体形式可被完整叶绿体摄取，并在其中加工为成熟蛋白。重组截短GPPS在大肠杆菌中表达为36 kDa蛋白，免疫亲和纯化后以DMAPP和[14C]IPP为底物专一合成GPP，不能利用GPP、FPP或GGPP作为烯丙基底物，抗GPPS抗血清可显著抑制其活性。离体拟南芥叶绿体实验表明，仅添加[14C]IPP时主要生成GPP/牻牛儿醇，加入25–50 μM DMAPP后仍专一生成GPP。免疫组织化学定位显示，GPPS与单萜合酶、DXS及GGPPS共同存在于拟南芥叶绿体、松针树脂道分泌细胞非绿色质体以及金橘油腔分泌细胞邻近光合薄壁细胞的叶绿体中。这些结果表明单萜合成并不局限于特化分泌结构，光合薄壁细胞也可能参与GPP的合成，该扩展区室化模型拓宽了对植物单萜生物合成组织与亚细胞分布的认识。
创新点
首次克隆并功能鉴定拟南芥同源二聚体GPPS；发现一个GPPS基因可通过两个起始Met产生分别可能靶向质体和胞质的异构体；利用免疫组化证明GPPS与单萜合酶、DXS、GGPPS同时存在于非绿色分泌质体和叶绿体中，提出单萜合成可在光合薄壁细胞中发生的扩展区室化模型。
研究对象（9）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Arabidopsis thaliana（拟南芥） | 质体单萜/异戊二烯生物合成 | GPPS（GenBank Y17376） | 香叶基二磷酸合酶（GPPS） | 催化 | cDNA长1266 bp，编码422个氨基酸；重组酶以DMAPP为底物专一生成GPP；Met1/Met102两个起始位点可能产生质体靶向和胞质型异构体 |
| Escherichia coli TOP10 | 重组蛋白表达 | 截短GPPS（自LLSNKL起始） | 重组GPPS | 催化 | 阿拉伯糖诱导表达36 kDa蛋白，免疫亲和纯化后与[14C]IPP和DMAPP孵育只生成GPP，抗GPPS抗体抑制活性 |
| Escherichia coli JM109 | 泛醌生物合成 | GPPS cDNA | GPPS | 催化 | 转化后仅形成泛醌-8，排除该酶参与高链长异戊二烯焦磷酸合成 |
| Capsicum annuum（辣椒）叶绿体 | 质体蛋白转运 | GPPS cDNA | GPPS前体蛋白 | 转运 | 体外转录翻译产生45 kDa和36-38 kDa两种多肽；仅45 kDa多肽被完整叶绿体摄入并被thermolysin保护 |
| 拟南芥叶绿体 | 质体单萜合成 | GPPS | 36-38 kDa GPPS | 区室化 | 免疫印迹证实叶绿体含GPPS；免疫亲和纯化的叶绿体GPPS在DMAPP存在下专一合成GPP |
| Pinus pinaster（松树）针叶分泌组织 | 单萜/树脂生物合成 | GPPS、GGPPS、单萜合酶 | GPPS/GGPPS/单萜合酶 | 区室化 | 免疫组化显示树脂道分泌细胞非绿色质体和邻近光合薄壁细胞叶绿体均阳性；pre-immune血清无标记 |
| Citrofortunella mitis（金橘）果皮分泌组织 | 单萜生物合成 | GPPS、单萜合酶 | GPPS/单萜合酶 | 区室化 | 油腔周围分泌细胞非绿色质体和薄壁细胞叶绿体均被标记；说明单萜合成可在特化分泌结构和光合薄壁细胞中同时发生 |
| 拟南芥基因组（染色体II/IV） | 单萜合成 | 推定单萜合酶ORF（AAD03382、CAB10448） | 推定的单萜合酶 | 催化 | 含单萜合酶特征双精氨酸基序；AAD03382预测具有质体转运肽 |
| 拟南芥/辣椒 | MEP途径 | DXS | 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶（DXS） | 催化 | 免疫荧光显示DXS与GPPS共同定位于质体，参与质体IPPGPP合成路径 |
关键发现
- 从拟南芥克隆的GPPS cDNA编码区长1266 bp，编码422个氨基酸，与拟南芥FPS的一致性为24.2%，与GGPPS的一致性为28.7%
- Northern blot显示1.26 kb和0.95 kb两种转录本
- 体外转录翻译产生约45 kDa和36-38 kDa两种多肽，仅45 kDa前体被完整叶绿体摄入
- 拟南芥叶绿体中检测到36-38 kDa的GPPS。重组截短GPPS在大肠杆菌中表达为36 kDa蛋白，免疫亲和纯化后以DMAPP和[14C]IPP为底物专一合成GPP，不能利用GPP、FPP或GGPP作烯丙基底物，抗GPPS抗血清显著抑制活性
- 转化GPPS cDNA的大肠杆菌JM109仅合成泛醌-8。离体拟南芥叶绿体仅加[14C]IPP时主要生成GPP/牻牛儿醇和牻牛儿基牻牛儿醇
- 加入25-50 μM DMAPP后生成GPP/牻牛儿醇
- 免疫亲和纯化的叶绿体GPPS在DMAPP存在下专一合成GPP。免疫组化显示GPPS、单萜合酶、DXS和GGPPS共同定位于拟南芥叶绿体、松针树脂道分泌细胞非绿色质体、金橘油腔分泌细胞非绿色质体及邻近光合薄壁细胞叶绿体。讨论中提及单萜浓度低至100 ppm即有生物毒性
- 猫薄荷每个腺毛可积累约30 ng nepetalactone
- 柠檬草和桉树叶中单萜积累量可达干重的1.5-20%。
研究结论
单萜前体GPP由定位在质体（叶绿体和非绿色质体）及胞质中的GPPS合成；单萜生物合成不局限于特化分泌结构，也可发生在光合薄壁细胞中，并可能受生物/非生物胁迫诱导。拟南芥基因组中存在两个推定单萜合酶ORF（AAD03382、CAB10448）支持这一新模型。