高级醇 · 代谢工程文献库

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A bifunctional epimerase-reductase acts downstream of the MUR1 gene product and completes the de novo synthesis of GDP-L-fucose in Arabidopsis

作者
Christopher P. Bonin, Wolf-Dieter Reiter
单位
University of Connecticut, Department of Molecular and Cell Biology, Storrs, CT 06269, USA; Institute of Materials Science, Storrs, CT 06269, USA
杂志
The Plant Journal（2000）
DOI
10.1046/j.1365-313x.2000.00698.x
所属领域
代谢工程
关键词
3,5-epimerase-4-reductaseArabidopsis thalianaGDP-L-fucoseMUR1cell wallnucleotide sugar
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解决的核心问题

拟南芥中GDP-L-岩藻糖从头合成途径中3,5-表异构化和4-还原步骤的酶基因尚未被克隆和鉴定，导致该途径无法完整重建。

研究策略

基于细菌荚膜合成基因（E. coli cps/rfb簇）的序列相似性，从拟南芥EST数据库中筛选候选基因GER1，通过异源表达纯化、体外酶活测定验证其双功能酶活性，并利用反义转基因植株分析其体内功能。

研究路线图

100%
研究问题：GDP-L-岩藻糖合成途径中表异构酶-还原酶基因未知
策略：基于细菌cps/rfb序列从EST库筛候选基因GER1
关键改造1：GER1克隆与异源表达纯化（35.5 kDa）
关键改造2：体外酶活测定（需NADPH，双功能验证）
关键改造3：MUR1+GER1体外完全转化GDP-D-甘露糖→GDP-L-岩藻糖
结果1：GER1反义株系酶活降低50倍，但细胞壁岩藻糖含量不变
结果2：GER1不参与GDP-L-半乳糖合成；GER2为同源基因（84%一致性）但有别于GER1
结论：GER1编码双功能3,5-表异构酶-4-还原酶，与MUR1重建完整从头合成途径
研究意义：完整阐明植物GDP-L-岩藻糖从头合成途径
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核心内容

该研究从拟南芥EST数据库中筛选到一个与细菌荚膜合成基因同源的候选序列，克隆并鉴定了编码GDP-4-酮-6-脱氧-D-甘露糖3,5-表异构酶-4-还原酶的双功能基因GER1。GER1编码312个氨基酸、约35 kDa的蛋白，基因无内含子，在根和花中高表达。异源表达纯化的GER1蛋白在NADPH存在下可将GDP-4-酮-6-脱氧-D-甘露糖完全转化为GDP-L-岩藻糖；将MUR1与GER1混合孵育GDP-D-甘露糖，也可完全生成GDP-L-岩藻糖，从而在体外重建了完整的从头合成途径。反义抑制GER1的转基因株系中，该酶活性降低约50倍，花序中L-岩藻糖占总放射性不足1%，而野生型约为50%，但细胞壁岩藻糖含量未受影响，说明体内存在补偿机制。研究还发现拟南芥基因组中存在氨基酸一致性达84%的GER2同源基因。该工作首次在植物中克隆了GDP-L-岩藻糖合成途径末两步的双功能酶基因，并排除了GER1参与GDP-L-半乳糖合成的可能，为该途径的完整重建和代谢工程应用奠定了基础。

创新点

首次在植物中克隆并鉴定了编码GDP-4-酮-6-脱氧-D-甘露糖3,5-表异构酶-4-还原酶的双功能基因GER1；证明MUR1和GER1组合可在体外将GDP-D-甘露糖完全转化为GDP-L-岩藻糖，重建完整从头合成途径；通过生化和体内实验排除了GER1参与GDP-L-半乳糖合成的可能性。

研究对象（4）

底盘细胞代谢通路基因蛋白功能说明
拟南芥 (Arabidopsis thaliana) GDP-L-岩藻糖从头合成途径 MUR1 MUR1 (GDP-D-甘露糖4,6-脱水酶) 催化 催化第一步：GDP-D-甘露糖生成GDP-4-酮-6-脱氧-D-甘露糖
拟南芥 (Arabidopsis thaliana) GDP-L-岩藻糖从头合成途径 GER1 GER1 (GDP-4-酮-6-脱氧-D-甘露糖3,5-表异构酶-4-还原酶) 催化 双功能酶，催化第二、三步：3,5-表异构化和4-还原，最终生成GDP-L-岩藻糖
拟南芥 (Arabidopsis thaliana) GDP-L-岩藻糖从头合成途径 GER2 GER2 (推定的同源蛋白) 催化 推测具有相似功能，但生化活性尚未验证
大肠杆菌 (Escherichia coli) BL21(DE3) GDP-L-岩藻糖从头合成途径（异源重构） GER1 GER1 (重组组氨酸标签蛋白) 催化 用于体外酶活测定，与MUR1共同将GDP-D-甘露糖转化为GDP-L-岩藻糖

关键发现

  1. GER1基因编码312个氨基酸的蛋白，预测分子量35.5 kDa，SDS-PAGE表观约35 kDa
  2. GER1基因无内含子，在根和花中高表达，转录本约1.5 kb
  3. 纯化的GER1蛋白可将GDP-4-酮-6-脱氧-D-甘露糖完全转化为GDP-L-岩藻糖，且需要NADPH作为辅因子
  4. MUR1和GER1混合孵育GDP-D-甘露糖可完全转化为GDP-L-岩藻糖
  5. GER1反义株系（GERA9a、GERA10b、GERA21b）花序中3,5-表异构酶-4-还原酶活性几乎检测不到（L-岩藻糖占总放射性<1%），而野生型和空载体植株约50%的GDP-D-甘露糖被转化为GDP-L-岩藻糖
  6. 反义株系中该酶活性降低约50倍，但细胞壁L-岩藻糖含量仍与野生型相同
  7. GER1反义株系L-抗坏血酸水平与野生型相同
  8. 拟南芥基因组中存在GER1同源基因GER2（cDNA克隆701667762与GER1编码区649-927位核苷酸序列一致性83%，氨基酸一致性84%）。

研究结论

GER1编码双功能的3,5-表异构酶-4-还原酶，在MUR1催化产物GDP-4-酮-6-脱氧-D-甘露糖的下游完成GDP-L-岩藻糖合成的最后两步，与MUR1共同构成完整的从头合成途径。GER1不参与GDP-L-半乳糖的合成，该反应由独立的GDP-D-甘露糖3,5-表异构酶催化。