The Molecular Cloning of Dihydroartemisinic Aldehyde Reductase and its Implication in Artemisinin Biosynthesis in Artemisia annua
- 作者
- Anna-Margareta Rydén, Carolien Ruyter-Spira, Wim J. Quax, Hiroyuki Osada, Toshiya Muranaka, Oliver Kayser, Harro Bouwmeester
- 单位
- Pharmaceutical Biology, University of Groningen, Groningen, The Netherlands; Plant Research International, Wageningen, The Netherlands; Kihara Institute for Biological Research, Yokohama City University, Yokohama, Japan; Chemical Biology Department, Antibiotics Laboratory, Advanced Science Institute, RIKEN, Saitama, Japan; Technical University Dortmund, Technical Biochemistry, Dortmund, Germany; Laboratory of Plant Physiology, Wageningen University, Wageningen, The Netherlands
- 杂志
- Planta Med（2010）
- DOI
- 10.1055/s-0030-1249930
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
青蒿素生物合成中双氢青蒿素醛是多个竞争酶的底物，部分酶可能对青蒿素产量产生负面影响。本研究旨在克隆并表征Red1（双氢青蒿素醛还原酶），阐明其在青蒿素生物合成网络中的作用。
研究策略
从青蒿（Artemisia annua）腺毛cDNA文库中筛选并克隆red1基因，在大肠杆菌中异源表达获得重组蛋白，通过体外酶活测定和动力学分析表征其底物偏好性与催化效率，结合半定量PCR分析该基因在植物不同组织中的时空表达模式，并与其他青蒿素生物合成基因比较。
核心内容
本研究从青蒿腺毛cDNA文库中克隆了编码双氢青蒿素醛还原酶的red1基因，并证实其属于短链脱氢酶/还原酶家族。在大肠杆菌中异源表达获得重组蛋白后，体外酶活测定显示Red1能催化双氢青蒿素醛还原为双氢青蒿素醇，其表观动力学参数为Km=67±15 μM、kcat=0.28 s⁻¹、kcat/Km=4119 M⁻¹·s⁻¹，同时对(−)-薄荷酮和紫苏醛也具有较高活性，但无法氧化双氢青蒿素醇，表明其具有广谱底物偏好且催化方向不可逆。转录分析显示red1在花蕾、幼花和带花粉老花中高表达，在无花粉花朵和茎中不表达，幼叶和老叶亦有较高表达，表达模式与青蒿素合成相关基因存在时空重叠。结合文献数据，酵母中缺失Dbr2使青蒿酸产量从11.8 μg/mL升至29.4 μg/mL，提示类似地沉默Red1可能减少双氢青蒿素醛向醇类的分流，从而提升青蒿素产量，为通过基因工程改良青蒿素生物合成提供了新的干预靶点。
创新点
首次克隆并表征了双氢青蒿素醛还原酶Red1，证明其属于短链脱氢酶/还原酶（SDR）家族，并发现Red1能将双氢青蒿素醛还原为双氢青蒿素醇，从而可能分流青蒿素生物合成通量，为通过基因沉默提高青蒿素产量提供了新靶点。
研究对象（7）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21 (DE3)-Rosetta2 | 青蒿素生物合成（异源表达） | red1 | dihydroartemisinic aldehyde reductase (Red1) | 催化 | 重组His-tagged蛋白用于动力学表征 |
| Artemisia annua | 青蒿素生物合成 | red1 | dihydroartemisinic aldehyde reductase (Red1) | 催化 | 在花和叶中表达，将双氢青蒿素醛还原为双氢青蒿素醇，属SDR家族 |
| Artemisia annua | 青蒿素生物合成 | amds | amorpha-4,11-diene synthase | 催化 | 催化FPP环化形成amorpha-4,11-diene，是途径第一步关键酶 |
| Artemisia annua | 青蒿素生物合成 | cyp71av1 | cytochrome P450 71av1 | 催化 | 氧化amorpha-4,11-diene生成青蒿醇、青蒿醛和青蒿酸 |
| Artemisia annua | 青蒿素生物合成 | dbr2 | double bond reductase 2 | 催化 | 还原青蒿醛的Δ11(13)双键生成双氢青蒿素醛 |
| Artemisia annua | 青蒿素生物合成 | aldh1 | alcohol dehydrogenase 1 | 催化 | 氧化双氢青蒿素醛为双氢青蒿酸 |
| Artemisia annua | 异戊二烯代谢（青蒿素前体合成） | fds | farnesyl diphosphate synthase | 催化 | 合成法尼基焦磷酸，各组织中稳定转录 |
关键发现
- Red1对双氢青蒿素醛的表观动力学参数：Km = 67 ± 15 μM，kcat =
- 28 s⁻¹，kcat/Km = 4119 M⁻¹·s⁻¹；对(-)-薄荷酮的Km =
- 1 ±
- 4 μM，kcat =
- 6 s⁻¹，kcat/Km = 83,617 M⁻¹·s⁻¹；不能氧化双氢青蒿素醇（Km > 1000 μM）；高效转化紫苏醛为紫苏醇。转录分析显示red1在花蕾（F1）、幼花（F2）和带花粉的老花（F4）中高表达，在完全开放无花粉的花中不表达，茎中不表达，幼叶和老叶中均高表达。另引用文献数据：在酵母中表达Dbr2的菌株产生11.8 μg/mL青蒿酸和15.7 μg/mL双氢青蒿酸，而无Dbr2的对照菌株产生29.4 μg/mL青蒿酸。
研究结论
Red1是一种广谱底物氧化还原酶，能够将青蒿素生物合成关键中间体双氢青蒿素醛还原为双氢青蒿素醇，从而对青蒿素合成产生负面影响。沉默Red1可能提高青蒿素产量，并有助于发现其他作用于青蒿素生物合成中间体的基因。