Isolation and Identification of Novel Genes Involved in Artemisinin Production from Flowers of Artemisia annua Using Suppression Subtractive Hybridization and Metabolite Analysis
- 作者
- Shuoqian Liu, Na Tian, Juan Li, Jianan Huang, Zhonghua Liu
- 单位
- Natural Products Research Center, Hunan Agricultural University, Changsha, P.R. China; College of Horticulture and Hardening, Hunan Agricultural University, Changsha, P.R. China
- 杂志
- Planta Med（2009）
- DOI
- 10.1055/s-0029-1185809
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
从青蒿（Artemisia annua）花中分离和鉴定参与青蒿素生物合成的新基因，解析青蒿素生物合成途径及其调控机制。
研究策略
采用抑制消减杂交（SSH）技术构建盛花期与花蕾期差异表达cDNA文库，结合代谢物分析（GC-ECD）和RT-PCR验证差异表达基因；通过茉莉酸（JA）处理研究候选基因TTG1与腺毛密度及青蒿素含量的关系。
核心内容
该研究以青蒿花为材料，通过抑制消减杂交技术构建了盛花期与花蕾期的差异表达cDNA文库，并结合代谢物分析与RT-PCR验证，系统挖掘参与青蒿素生物合成的新基因。结果显示，盛花期青蒿素含量约为花蕾期的3倍，单花总青蒿素在盛开期为开花前期的约5倍。消减文库共获得253条可用EST序列，其中70.3%有已知功能同源，9.9%涉及类异戊二烯途径，比例高于叶片腺毛文库的8%。RT-PCR证实DXR、FPS、ADS、CYP71AV1等关键酶基因在盛花期表达上调。首次从青蒿中克隆到乙酰乙酰辅酶A硫解酶和甲羟戊酸激酶EST，并报道了与毛状体起始相关的转录因子TTG1和GL3。茉莉酸处理实验表明，腺毛密度在14天达到峰值（86.6±3.7对41.7±1.9个/mm²），青蒿素含量增至对照约200%（6.18对3.65 μg/mg），且TTG1表达在7天最高，腺毛密度与青蒿素含量相关系数R²达0.941。该研究揭示了盛花期青蒿素合成基因协同上调的机制，并证明TTG1可能通过促进腺毛形成正向调控青蒿素生物合成，为通过遗传改造提高青蒿素产量提供了重要候选靶点。
创新点
首次从青蒿中克隆到编码乙酰乙酰辅酶A硫解酶（ACAT）和甲羟戊酸激酶（MK）的EST；首次报道青蒿中与毛状体起始相关的转录因子TTG1和GL3；实验证明茉莉酸诱导的TTG1表达增强与腺毛密度和青蒿素产量提高直接相关。
研究对象（10）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Artemisia annua | 青蒿素生物合成（类异戊二烯途径） | FPS | 法尼基焦磷酸合酶 | 催化 | 催化IPP/DMAPP缩合生成法尼基焦磷酸（FPP） |
| Artemisia annua | 青蒿素生物合成（甲基赤藓醇磷酸途径） | DXR | 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶 | 催化 | MEP途径中的关键酶，RT-PCR确认在盛花期高表达 |
| Artemisia annua | 青蒿素生物合成（后FPP阶段） | ADS | 紫穗槐-4,11-二烯合酶 | 催化 | 催化FPP环化生成紫穗槐-4,11-二烯，青蒿素生物合成第一步 |
| Artemisia annua | 青蒿素生物合成（后FPP阶段） | CYP71AV1 | 细胞色素P450单加氧酶 | 催化 | 多功能酶，氧化紫穗槐二烯生成青蒿酸 |
| Artemisia annua | 甲羟戊酸途径 | ACAT | 乙酰乙酰辅酶A硫解酶 | 催化 | 首次在青蒿中获得该EST |
| Artemisia annua | 甲羟戊酸途径 | MK | 甲羟戊酸激酶 | 催化 | 首次在青蒿中获得该EST |
| Artemisia annua | 青蒿素生物合成（后FPP阶段） | DBR2 | 青蒿醛Δ11(13)双键还原酶 | 催化 | 本文未在消减文库中发现该EST，但在讨论中提及 |
| Artemisia annua | 类胡萝卜素裂解 | CCD2 | 类胡萝卜素裂解双加氧酶2 | 催化 | 5个EST与莴苣CCD2同源，高表达与青蒿素积累相关 |
| Artemisia annua | 毛状体起始调控 | TTG1 | TRANSPARENT TESTA GLABRA1 | 调控 | 转录因子，促进腺毛起始，JA处理后表达上调并与青蒿素含量正相关 |
| Artemisia annua | 毛状体起始调控 | GL3 | ENHANCER OF GLABRA3 | 调控 | 转录因子，参与腺毛起始，在消减文库中发现 |
关键发现
- 盛花期青蒿素含量约为花蕾期的3倍（干重），单花总青蒿素在盛开期为开花前期的约5倍；构建了含350个cDNA克隆的消减文库，获得253条可用EST序列，其中70.3%有已知功能同源，29.7%无相似性
- 9%的EST涉及类异戊二烯途径（高于叶片腺毛文库的8%）；RT-PCR证实DXR、FPS、ADS、CYP71AV1在盛花期表达上调；茉莉酸处理使腺毛密度在14天达最高（86.6±3.7 vs
- 7±1.9个/mm²，约为对照2倍），青蒿素含量在14天增至对照约200%（6.18±0.29 vs
- 65±0.13 μg/mg）；TTG1表达在7天最高；腺毛密度与青蒿素含量相关系数R²=0.941。
研究结论
研究表明盛花期青蒿素生物合成相关基因表达上调，SSH文库为解析青蒿素生物合成提供了丰富候选基因；TTG1可能通过促进腺毛形成正向调控青蒿素生物合成，是提高青蒿素产量的潜在遗传改造靶点。