Isoprenoid Pyrophosphate-Dependent Transcriptional Regulation of Carotenogenesis in Corynebacterium glutamicum
- 作者
- Nadja A. Henke, Sabine A. E. Heider, Silvin Hannibal, Volker F. Wendisch, Petra Peters-Wendisch
- 单位
- Genetics of Prokaryotes, Faculty of Biology, Center for Biotechnology, Bielefeld University, Bielefeld, Germany
- 杂志
- Frontiers in Microbiology（2017）
- DOI
- 10.3389/fmicb.2017.00633
- 所属领域
- 代谢工程 / 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
谷氨酸棒状杆菌中类胡萝卜素（C50色素十异戊二烯黄素）生物合成的转录调控机制尚不清楚，特别是位于crt操纵子上游的MarR型调控因子CrtR（cg0725）的功能未被表征。
研究策略
通过基因缺失/过表达、DNA微阵列转录组分析、GFP转录融合报告系统、凝胶阻滞迁移分析（EMSA）、体外效应物筛选以及代谢工程改造产类胡萝卜素菌株，系统研究CrtR对crt操纵子的调控机制及其应用潜力。
核心内容
该研究系统揭示了谷氨酸棒状杆菌中MarR型调控因子CrtR对类胡萝卜素合成途径的转录调控机制。通过基因缺失与过表达、转录组分析、GFP报告系统及EMSA等实验，证实CrtR是crt操纵子和自身基因的转录抑制因子，可直接结合crtE启动子-10/-35区域的TTAA基序。体外效应物筛选发现异戊二烯焦磷酸类代谢中间物（IPP、DMAPP、GPP、FPP、GGPP）及MEP途径前体甘油醛-3-磷酸可作为诱导物解除CrtR的DNA结合活性，其中GGPP在50 μM最低浓度下即可完全抑制结合。敲除crtR可使crt操纵子转录水平提高10-70倍，使十异戊二烯黄素产量从0.24 mg/g CDW提升至3.57 mg/g CDW，约15倍，而crtR过表达则使产量降低5-6倍。该调控策略在多种工程菌株中同样有效，使番茄红素产量提高约5倍，β-胡萝卜素及C50色素产量提高1.5-2倍。该研究首次阐明了类异戊二烯焦磷酸依赖的转录调控机制，并将crtR缺失确立为提升多种天然及非天然类胡萝卜素产量的通用代谢工程策略。
创新点
首次揭示MarR型调控因子CrtR以异戊二烯焦磷酸（IPP、DMAPP、GPP、FPP、GGPP）及MEP途径前体甘油醛-3-磷酸（GAP）为效应物，调控类胡萝卜素合成；阐明了CrtR结合位点（TTAA基序）位于crtE启动子-10/-35区域；并将crtR缺失作为通用代谢工程策略提升天然及非天然类胡萝卜素产量。
研究对象（12）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 (WT) 及 MB001 | 类胡萝卜素生物合成（十异戊二烯黄素合成途径） | crtR (cg0725) | CrtR | 调控 | MarR型转录调控因子，抑制crt操纵子及自身表达，异戊二烯焦磷酸作为诱导物 |
| Corynebacterium glutamicum | 类胡萝卜素生物合成（crt操纵子） | crtE (cg0723) | GGPP合酶 | 催化 | crt操纵子第一个基因，催化GGPP合成（但主要GGPP合酶为IdsA） |
| Corynebacterium glutamicum | 类胡萝卜素生物合成 | idsA (cg2384) | IdsA | 催化 | 主要的香叶基香叶基焦磷酸合酶，编码于染色体其他位置 |
| Corynebacterium glutamicum | 类胡萝卜素生物合成（crt操纵子） | crtB (cg0721) | 八氢番茄红素合酶 | 催化 | 将GGPP转化为八氢番茄红素 |
| Corynebacterium glutamicum | 类胡萝卜素生物合成（crt操纵子） | crtI (cg0720) | 八氢番茄红素脱氢酶 | 催化 | 催化八氢番茄红素脱氢生成番茄红素 |
| Corynebacterium glutamicum | 类胡萝卜素生物合成（crt操纵子） | crtYc (cg0719) | C50 ε-环化酶 | 催化 | 参与decaprenoxanthin的ε环形成 |
| Corynebacterium glutamicum | 类胡萝卜素生物合成（crt操纵子） | crtYf (cg0718) | C50 ε-环化酶 | 催化 | 与CrtYc共同参与ε-环化 |
| Corynebacterium glutamicum | 类胡萝卜素生物合成（crt操纵子） | crtEb (cg0717) | 番茄红素延长酶 | 催化 | 催化C50类胡萝卜素碳链延长 |
| Corynebacterium glutamicum | 类胡萝卜素生物合成（crt操纵子） | cg0722 | 推测多药外排蛋白（RND超家族） | 转运 | crt操纵子中功能未知的基因，推测参与外排运输 |
| Corynebacterium glutamicum LYC5 | MEP途径（类萜前体供给） | dxs | 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶 | 催化 | 在LYC5中启动子被替换为Ptrf以增强MEP途径通量 |
| Corynebacterium glutamicum LYC5 (pEKEx3-crtE2Y) | sarcinaxanthin生物合成 | crtE2Y | CrtE2/CrtY（来自Micrococcus luteus） | 催化 | 异源表达用于合成γ-环状C50类胡萝卜素sarcinaxanthin |
| Corynebacterium glutamicum LYC5 (pEKEx3-lbtABC) | C.p.450生物合成 | lbtABC | LbtA/LbtB/LbtC（来自Dietzia sp. CQ4） | 催化 | 异源表达用于合成β-环状C50类胡萝卜素C.p.450 |
关键发现
- crtR缺失使crt操纵子基因转录水平提高10-70倍（微阵列数据）
- crtR缺失时crtE启动子活性提高约5倍，crtR自身启动子活性提高约2倍
- crtR直接结合crtE-crtR间区中的TTAA基序，突变该基序后结合消失
- GGPP在50 μM最低浓度下即可完全抑制CrtR-DNA结合，FPP/GPP/IPP/DMAPP在250 μM时有效，GAP在2 mM时有效
- crtR缺失使野生型decaprenoxanthin产量从0.24±0.03 mg/g CDW提高到3.57±0.12 mg/g CDW（约15倍，文中描述为10-30倍），crtR过表达使产量降低至0.05±0.01 mg/g CDW（降低5-6倍）
- 在工程菌LYC5中敲除crtR使番茄红素产量提高约5倍，在BETA3（β-胡萝卜素）、sarcinaxanthin和C.p.450生产菌株中敲除crtR使产量提高1.5-2倍。
研究结论
CrtR是C. glutamicum中crt操纵子和自身基因的转录抑制因子，异戊二烯焦磷酸类中间代谢物作为诱导物解除其DNA结合，从而调控类胡萝卜素合成。crtR缺失是一种有效的调控工程策略，可提升多种天然和非天然C40/C50类胡萝卜素的产量。