Identification of Class 2 1-Deoxy-D-xylulose 5-Phosphate Synthase and 1-Deoxy-D-xylulose 5-Phosphate Reductoisomerase Genes from Ginkgo biloba and Their Transcription in Embryo Culture with Respect to Ginkgolide Biosynthesis
- 作者
- Sang-Min Kim, Tomohisa Kuzuyama, Yung-Jin Chang, Kwang-Seop Song, Soo-Un Kim
- DOI
- 10.1055/s-2005-916180
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
克隆并鉴定银杏内酯生物合成MEP途径中两个早期酶基因GbDxS2和GbDXR的功能，并分析其转录与银杏内酯积累的关系。
研究策略
基于保守区域设计简并引物，通过RT-PCR和RACE从银杏胚根克隆全长cDNA；利用大肠杆菌dxs和dxr敲除突变体进行功能互补验证；用实时PCR检测基因表达，HPLC测定银杏内酯含量。
核心内容
本研究从银杏胚根中克隆并鉴定了MEP途径两个早期酶基因GbDxS2与GbDXR。通过简并引物RT-PCR及RACE获得全长cDNA，其中GbDxS2开放阅读框长2217 bp，编码739个氨基酸，推测蛋白分子量为71.5 kDa，与已知class 2 DXS同源性约80%；GbDXR开放阅读框长1434 bp，编码478个氨基酸，推测分子量46 kDa。功能互补实验表明，GbDxS2和GbDXR可分别回补大肠杆菌dxs与dxr敲除突变株DXM3和DYM1的生长缺陷，证明二者编码MEP途径功能酶。实时PCR转录分析显示，GbDxS2主要在根中转录，且在胚培养第1周表达最强，随后下降；GbDXR在叶中表达量约为根的50%–70%；而GbDxS1在叶中较根高30%–50%。银杏内酯含量测定表明，根中含量仅为叶的1/3–1/4，但第1周两者相当。结合GbDxS2与LPS仅在根中转录，证实银杏内酯在根中合成后转运至叶片积累，GbDxS2特异性参与该过程。该工作为阐明银杏内酯组织特异性生物合成及其转运机制提供了关键酶学与转录证据。
创新点
首次克隆并功能鉴定了银杏的class 2 DXS和DXR基因；发现GbDxS2与LPS仅在根中转录，证实银杏内酯在根中合成并转运至叶。
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli DXM3 (dxs敲除株) | MEP途径 | GbDxS2 | 1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸合酶 | 催化 | 互补实验验证功能，GenBank AY494185 |
| Escherichia coli DYM1 (dxr敲除株) | MEP途径 | GbDXR | 1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸还原异构酶 | 催化 | 互补实验验证功能，GenBank AY494186 |
| 银杏胚根 | MEP途径 | GbDxS2 | 1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸合酶 | 催化 | 仅在根中转录，与LPS转录模式一致 |
| 银杏胚根和叶 | MEP途径 | GbDXR | 1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸还原异构酶 | 催化 | 根中转录水平高于叶，叶中水平为根的50-70% |
| 银杏胚培养 | MEP途径 | GbDxS1 | 1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸合酶 | 催化 | class 1 DXS，叶中转录水平比根高30-50% |
| 银杏胚根 | 银杏内酯生物合成 | LPS | 左松脂烯合酶 | 催化 | 催化银杏内酯生物合成第一步环化反应，仅在根中转录 |
关键发现
- 克隆得到GbDxS2 ORF长2217 bp，编码739个氨基酸，预测成熟蛋白分子量71.5 kDa，pI
- 30；GbDXR ORF长1434 bp，编码478个氨基酸，成熟蛋白分子量46 kDa，pI
- 57。GbDxS2与已知class 2 DXS同源性约80%，GbDXR与其他DXR同源性85-92%。通过质粒pMW-DXS和pMW-DXR分别回补E. coli DXM3和DYM1，使突变株能在无ME培养基生长。转录分析显示根中GbDxS2和LPS在胚培养1周时最强，随后下降；GbDxS2主要在根中转录；GbDXR在叶中水平为根的50-70%；GbDxS1在叶中比根高30-50%。银杏内酯含量方面，根中含量为叶的1/3-1/4，但第1周两者相当。
研究结论
GbDxS2和GbDXR是MEP途径的功能酶，其中GbDxS2特异性参与银杏内酯生物合成；银杏内酯在根中合成后通过转运在叶片中积累。