The final acylation step in Taxol biosynthesis: Cloning of the taxoid C13-side-chain N-benzoyltransferase from Taxus
- 作者
- Kevin Walker, Robert Long, Rodney Croteau
- 单位
- Institute of Biological Chemistry, Washington State University, Pullman, WA 99164-6340
- 杂志
- Proceedings of the National Academy of Sciences（2002）
- DOI
- 10.1073/pnas.082115799
- 所属领域
- 代谢工程 / 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
克隆并鉴定紫杉醇(Taxol)生物合成途径中最后一步N-苯甲酰化反应的催化酶基因，为工程化生产紫杉醇及其类似物提供关键工具。
研究策略
从经茉莉酸甲酯诱导的Taxus cuspidata细胞cDNA文库中获取多个酰基转移酶候选克隆，在大肠杆菌BL21(DE3)中异源表达，以化学合成的替代底物N-去苯甲酰-(3'RS)-2'-脱氧紫杉醇和苯甲酰CoA进行功能筛选，鉴定出催化N-苯甲酰化的TAX10（DBTNBT）基因，并通过产物结构鉴定和酶动力学表征确认其功能。
核心内容
该研究从经茉莉酸甲酯诱导的Taxus cuspidata细胞cDNA文库中克隆了紫杉醇生物合成最后一步的关键酶基因DBTNBT（TAX10）。通过在大肠杆菌BL21(DE3)中异源表达多个候选酰基转移酶，并以化学合成的替代底物N-去苯甲酰-(3'RS)-2'-脱氧紫杉醇和苯甲酰CoA进行功能筛选，成功鉴定出催化N-苯甲酰化的酶。重组酶的cDNA开放阅读框为1,323 bp，编码441个氨基酸，分子量约49 kDa；最适pH为8.0，kcat约为1.5 s⁻¹，对两种底物的Km分别为0.42 mM和0.40 mM。产物经radioHPLC、¹H-NMR和化学电离-MS确认。该酶对3'-氨基位置具有区域专一性，且苯甲酰CoA为优选酰基供体，乙酰-CoA和苯乙酰-CoA不能作为底物。序列分析显示其与Taxus其他酰基转移酶的一致性为58–69%。这一发现使紫杉醇途径中已功能性表达的基因增至8个，覆盖约20步途径的近一半，为工程化生产紫杉醇及通过连接修饰芳基改善药物水溶性提供了重要工具。
创新点
首次克隆了紫杉醇生物合成最后一步的N-苯甲酰转移酶基因DBTNBT；建立了简便的四步半合成方法制备替代底物N-去苯甲酰-(3'RS)-2'-脱氧紫杉醇；从多个未鉴定的酰基转移酶克隆中通过功能筛选精准锁定目标酶；发现该酶具有立体选择性，产物中一种差向异构体过量40%；该酶有望用于紫杉醇类似物的生物合成。
研究对象（1）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21(DE3) | 紫杉醇(Taxol)生物合成途径 | TAX10 (DBTNBT, GenBank AF466397) | 3'-N-debenzoyl-2'-deoxytaxol N-benzoyltransferase (DBTNBT) | 催化 | 催化紫杉醇生物合成最后一步，即N-去苯甲酰-2'-脱氧紫杉醇的3'-氨基与苯甲酰辅酶A的N-苯甲酰化反应 |
关键发现
克隆的DBTNBT cDNA ORF为1,323 bp，编码441个氨基酸，蛋白分子量49,040 Da。重组酶最适pH为8.0，kcat约1.5±0.3 s⁻¹，对N-去苯甲酰-2'-脱氧紫杉醇和苯甲酰-CoA的Km分别为0.42 mM和0.40 mM。该酶催化N-去苯甲酰-(3'RS)-2'-脱氧紫杉醇与苯甲酰-CoA反应生成2'-脱氧紫杉醇，产物经radioHPLC、¹H-NMR和化学电离-MS确认。酶对3'-氨基位置区域专一，苯甲酰-CoA是优选酰基供体，乙酰-CoA和苯乙酰-CoA不能作为底物。DBTNBT与其他Taxus酰基转移酶序列同一性为58-69%，与Dianthus的N-苯甲酰转移酶一致性53%，与taxane 2α-O-苯甲酰转移酶一致性60%。
研究结论
DBTNBT催化紫杉醇生物合成的最后一步（侧链N-苯甲酰化），该基因的鉴定使紫杉醇途径中已功能性表达的基因增至8个，覆盖约20步途径中的近一半。该酶不仅可用于提高紫杉醇在工程宿主中的产量，还可通过连接修饰的芳基到紫杉烷前体上以改善药物水溶性和药效。