Mutations in degP and spoT Genes Mediate Response to Fermentation Stress in Thermally Adapted Strains of Acetic Acid Bacterium Komagataeibacter medellinensis NBRC 3288
- 作者
- Naoya Kataoka, Minenosuke Matsutani, Nami Matsumoto, Misuzu Oda, Yuki Mizumachi, Kohei Ito, Shuhei Tanaka, Yu Kanesaki, Toshiharu Yakushi, Kazunobu Matsushita
- 单位
- Department of Biological Chemistry, Faculty of Agriculture, Yamaguchi University; Graduate School of Sciences and Technology for Innovation, Yamaguchi University; Research Center for Thermotolerant Microbial Resources, Yamaguchi University; NODAI Genome Research Center, Tokyo University of Agriculture; Research Institute of Green Science and Technology, Shizuoka University
- 杂志
- Frontiers in Microbiology（2022）
- DOI
- 10.3389/fmicb.2022.802010
- 所属领域
- 发酵工程
- 关键词
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解决的核心问题
阐明醋酸菌Komagataeibacter medellinensis NBRC 3288在高温醋发酵条件下通过实验进化获得耐热及发酵胁迫耐受能力的分子机制，尤其是degP和spoT基因突变的作用。
研究策略
采用实验进化策略，在含乙酸和乙醇的发酵培养基中逐步提高培养温度（34°C至35°C）获得适应菌株ITO-1、ITO-2和ITO-3；通过基因组重测序、转录组分析、基因敲除/回补及显微观察等，解析degP和spoT突变对细胞表面稳定性、细胞大小、ROS水平和严紧反应的影响。
核心内容
该研究通过实验进化策略，在含乙酸和乙醇的发酵培养基中逐步提高温度（34°C至35°C），从醋酸菌Komagataeibacter medinellensis NBRC 3288获得三株耐热进化株ITO-1、ITO-2和ITO-3，其中ITO-3可在35°C下正常生长和产酸，而野生型无法在34°C以上存活。基因组重测序和转录组分析鉴定出ito-1携带gyrB、degP和spoT三个基因突变，其中degP基因的12 bp插入属于功能获得性突变，通过抑制膜囊泡形成稳定细胞表面结构；spoT基因的424 bp缺失则截短C端调控结构域，特别是缺失Act-4区域，诱导(p)ppGpp积累并触发严紧反应，使细胞长度在发酵条件下由野生型的5.5 μm降至3.8 μm，同时增强胁迫基因表达。基因敲除和回补实验证实两个突变协同作用赋予耐热表型，且缺失Act-4的spoT突变体仅在发酵条件下耐受高温，而缺失整个C端结构域的突变体则在所有条件下均表现耐受。在另一醋酸菌A. pasteurianus SKU1108中敲除Act-4后，细胞中位长度由1.87 μm降至1.48 μm并赋予40°C下的生长能力，验证了该机制的跨菌种保守性。该研究揭示了degP和spoT突变通过稳定细胞表面和增强严紧反应协同赋予醋酸菌高温醋发酵鲁棒性的分子机制。
创新点
识别出degP基因12 bp插入和spoT基因424 bp缺失两个功能获得性突变协同赋予耐热表型；揭示degP突变通过抑制膜囊泡形成稳定细胞表面，spoT突变通过截短C端调控结构域（特别是Act-4）诱导ppGpp积累和细胞尺寸减小，从而增强发酵胁迫耐受性；并在另一醋酸菌A. pasteurianus中验证了Act-4缺失的表型。
研究对象（9）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Komagataeibacter medellinensis NBRC 3288 | 蛋白质量控制/细胞包膜应激响应 | degP | DegP | 催化 | 周质丝氨酸内肽酶/分子伴侣；ITO-1中12 bp插入导致额外4个氨基酸，突变增强细胞表面稳定性并减少膜囊泡 |
| Komagataeibacter medellinensis NBRC 3288 | (p)ppGpp严紧反应 | spoT | SpoT | 调控 | ppGpp合成/水解酶；ITO-1中缺失C端424 bp（含Act-4结构域），影响细胞大小和耐热性 |
| Komagataeibacter medellinensis NBRC 3288 | DNA复制 | gyrB | GyrB | 催化 | DNA旋转酶B亚基；ITO-1中12 bp缺失，但过表达无表型效应，未深入研究 |
| Komagataeibacter medellinensis NBRC 3288 | 乙醇氧化/醋发酵 | adhAB | PQQ-乙醇脱氢酶 | 催化 | 催化乙醇氧化为乙醛；发酵条件下表达下调，高温下在ITO-1中表达高于野生型 |
| Komagataeibacter medellinensis NBRC 3288 | 乙醇氧化/醋发酵 | aldFGH | 膜结合乙醛脱氢酶 | 催化 | 催化乙醛氧化为乙酸；在ITO-1中高温下表达上调 |
| Komagataeibacter medellinensis NBRC 3288 | 呼吸链/能量代谢 | aptABCDEFGH | F1F0-ATP合酶 | 能量供给 | 合成ATP；发酵条件下受抑制，但在34°C下ITO-1中表达水平高于野生型 |
| Komagataeibacter medellinensis NBRC 3288 | 呼吸链/能量代谢 | nuoDEFGHIJKLM | I型NADH脱氢酶（NDH-1） | 能量供给 | 将NADH氧化并泵出质子；在高温发酵条件下ITO-1中表达上调 |
| Komagataeibacter medellinensis NBRC 3288 | 呼吸链/能量代谢 | cyaABCD | H+泵型泛醇氧化酶 | 能量供给 | 末端氧化酶，参与电子传递和质子泵；在ITO-1高温发酵时表达增加 |
| Acetobacter pasteurianus SKU1108 | (p)ppGpp严紧反应 | spoT (APT_00593) | SpoT（Act-4缺失突变体） | 调控 | 用于验证SpoT缺失Act-4结构域对热耐受和细胞长度的影响，ΔApAct在40°C仍可生长 |
关键发现
- 实验进化获得三株耐高温醋酸菌（ITO-1/2/3），其中ITO-3可在35°C生长并产酸，而野生型不能在34°C以上正常生长。ITO-1含有gyrB（12 bp缺失）、degP（12 bp插入）和spoT（424 bp缺失）三个基因突变。在YPGAE发酵培养基34°C下，野生型细胞中位长度为5.5 μm，而ITO-1和ITO-3均为3.8 μm
- 在YPG非发酵培养基34°C下，野生型为7.7 μm，ITO-1为12.4 μm，ΔTGSAct为4.2 μm。ΔdegP菌株在34°C YPGAE上不能生长，在30°C即积累大量膜囊泡（脂质/蛋白比1.6-8.4），而ITO-1的囊泡生成减少。缺失整个CTD的ΔTGSAct突变体在发酵和非发酵条件下均耐受高温，缺失Act-4的ΔAct-4突变体仅在发酵条件下耐受高温（与ITO-1类似）。在A. pasteurianus中敲除Act-4（ΔApAct）后，细胞长度中位数由野生型SKU1108的1.87 μm降至1.48 μm，并赋予40°C下的生长能力。
研究结论
通过实验进化，K. medellinensis获得了耐热和耐酸/醇能力。ITO-1中的degP和spoT突变均为功能获得性突变：DegP突变稳定细胞表面结构，减少膜囊泡产生；SpoT截短（缺失Act-4）在发酵条件下诱导(p)ppGpp介导的严紧反应，降低细胞尺寸并增强胁迫基因表达。两者共同作用使菌株在高温醋发酵中表现出鲁棒性。