Reiterative Recombination for the in vivo assembly of libraries of multigene pathways
- 作者
- Laura M. Wingler, Virginia W. Cornish
- 单位
- Department of Chemistry, Columbia University
- 杂志
- Proceedings of the National Academy of Sciences（2011）
- DOI
- 10.1073/pnas.1100507108
- 所属领域
- 代谢工程 / 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
体内构建多基因通路和通路文库的效率低下，现有技术难以同时实现高效率和可扩展性。
研究策略
开发“重复重组”（Reiterative Recombination）技术，利用归位内切酶（HO和SceI）在受体模块中产生双链断裂，刺激同源重组，配合可回收的选择标记（HIS3/LEU2），在酵母染色体上逐步组装多基因通路，并通过循环操作实现无限延伸。
核心内容
本研究开发了一种名为“重复重组”（Reiterative Recombination）的体内DNA组装技术，旨在解决多基因通路及通路文库构建效率低下的问题。该策略利用归位内切酶HO和SceI在酿酒酵母染色体受体模块中引入双链断裂，刺激同源重组，并配合可回收的HIS3/LEU2选择标记，实现多基因的逐步整合与循环延伸。研究首先成功组装了包含lacZ、gusA和MET15三个报告基因的8.5 kb染色体构建物，每个报告基因在75–100%的重组子中具有功能；随后组装了番茄红素生物合成通路（crtE、crtB、crtI），99%的重组子呈现橙色表型。通过TRP1筛选，从模拟文库中回收了预期频率的菌株，文库复杂度达10^4，在100:1 stop:silent比例下观察到0.9%的橙色菌落，与理论预期相符。单次转化可获得10^6–10^8个转化子。该技术仅需PCR和转化即可完成多基因整合，无需复杂体外操作，为代谢工程和合成生物学中通路优化与大型文库构建提供了一种简单、高效且可普及的工具。
创新点
首次在酿酒酵母中建立重复重组系统；利用正交归位内切酶和可回收标记实现高效、循环的体内组装；无需复杂体外操作，仅需PCR和转化即可完成多基因整合；首次证明该技术能构建至少10^4规模的多基因通路文库。
研究对象（12）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae | 同源重组修复 | HO | HO endonuclease | 催化 | 归位内切酶，诱导双链断裂，用于刺激同源重组 |
| Saccharomyces cerevisiae | 同源重组修复 | SceI | SceI endonuclease | 催化 | 归位内切酶，诱导双链断裂，与HO交替使用 |
| Saccharomyces cerevisiae | 番茄红素生物合成（类异戊二烯途径） | crtE | GGPP合酶 | 催化 | 来自Erwinia herbicola，第1轮整合，催化牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成 |
| Saccharomyces cerevisiae | 番茄红素生物合成（类异戊二烯途径） | crtB | 八氢番茄红素合酶 | 催化 | 来自Erwinia herbicola，第2轮整合，催化八氢番茄红素合成 |
| Saccharomyces cerevisiae | 番茄红素生物合成（类异戊二烯途径） | crtI | 八氢番茄红素脱氢酶 | 催化 | 来自Erwinia herbicola，第3轮整合，催化八氢番茄红素脱氢生成番茄红素 |
| Saccharomyces cerevisiae | 报告基因系统 | lacZ | β-半乳糖苷酶 | 催化 | 第1轮整合的报告基因，用于表型检测 |
| Saccharomyces cerevisiae | 报告基因系统 | gusA | β-葡萄糖醛酸酶 | 催化 | 第2轮整合的报告基因 |
| Saccharomyces cerevisiae | 甲硫氨酸合成 | MET15 | O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶 | 催化 | 第3轮整合，互补甲硫氨酸营养缺陷 |
| Saccharomyces cerevisiae | 组氨酸合成 | HIS3 | 咪唑甘油磷酸脱水酶 | 催化 | 可回收选择标记，与LEU2交替使用 |
| Saccharomyces cerevisiae | 亮氨酸合成 | LEU2 | β-异丙基苹果酸脱氢酶 | 催化 | 可回收选择标记，与HIS3交替使用 |
| Saccharomyces cerevisiae | 尿嘧啶合成 | URA3 | 乳清苷-5'-磷酸脱羧酶 | 催化 | 用于正负筛选，通过FOA培养基去除供体质粒 |
| Saccharomyces cerevisiae | 色氨酸合成 | TRP1 | N-(5'-磷酸核糖基)邻氨基苯甲酸异构酶 | 催化 | 第3轮额外整合，作为文库筛选的最终选择标记 |
关键发现
- 成功组装了包含lacZ、gusA和MET15三个报告基因的8.5 kb染色体构建物，每个报告基因在75-100%的重组子中有功能
- 番茄红素生物合成通路（crtE、crtB、crtI）组装后，99%的重组子呈现橙色表型
- 通过TRP1筛选，从模拟文库中回收了预期频率的番茄红素产生菌株，文库复杂度达10^4，观察到的橙色菌落比例与预期相符（例如100:1 stop:silent比例下为0.9%，P>0.1）
- 单次转化可获得10^6-10^8个转化子，诱导步骤每毫升培养物至少产生10^4个重组子。
研究结论
重复重组是一种简单、高效、可普及的体内DNA组装方法，能够直接在酵母染色体上构建多基因通路和大型文库，适用于代谢工程和合成生物学中的通路优化与细胞工程。