Combinatorial biosynthesis of sapogenins and saponins in Saccharomyces cerevisiae using a C-16α hydroxylase from Bupleurum falcatum
- 作者
- Tessa Moses, Jacob Pollier, Lorena Almagro, Dieter Buyst, Marc Van Montagu, María A. Pedreño, José C. Martins, Johan M. Thevelein, Alain Goossens
- 单位
- Department of Plant Systems Biology, VIB, 9052 Gent, Belgium; Department of Plant Biotechnology and Bioinformatics, Ghent University, 9052 Gent, Belgium; Department of Molecular Microbiology, VIB, 3001 Leuven-Heverlee, Belgium; Laboratory of Molecular Cell Biology, Institute of Botany and Microbiology, Katholieke Universiteit Leuven, 3001 Leuven-Heverlee, Belgium; Department of Plant Biology, Faculty of Biology, Universidad de Murcia, 30100 Murcia, Spain; Department of Organic Chemistry, Ghent University, 9000 Gent, Belgium
- 杂志
- Proceedings of the National Academy of Sciences（2014）
- DOI
- 10.1073/pnas.1323369111
- 所属领域
- 代谢工程/合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
从柴胡（Bupleurum falcatum）中鉴定参与柴胡皂苷生物合成的细胞色素P450酶，并在酿酒酵母中重建和优化三萜皂苷元及单糖基化皂苷的异源合成。
研究策略
通过茉莉酸甲酯处理的柴胡根转录谱分析，鉴定出与已知三萜皂苷合成基因共调控的候选P450基因CYP716Y1；利用酵母底盘工程（下调羊毛甾醇合酶、表达截短HMG-CoA还原酶）构建高产β-香树脂醇等三萜的菌株；组合表达不同植物的OSC、P450和UGT基因实现组合生物合成；开发甲基-β-环糊精（MβCD）培养基添加策略，将疏水性三萜从酵母细胞螯合至培养基中，解除产物抑制并提高产量。
核心内容
该研究从柴胡中鉴定出参与三萜皂苷生物合成的细胞色素P450酶CYP716Y1，并在酿酒酵母中实现了三萜皂苷元及单糖基化皂苷的异源合成。通过茉莉酸甲酯处理的转录谱分析，发现CYP716Y1与已知皂苷合成基因共调控，功能表征显示其催化β-香树脂醇和α-香树脂醇的C-16α羟基化，但对羽扇豆醇无活性。研究团队通过下调羊毛甾醇合酶、表达截短HMG-CoA还原酶等底盘工程优化，使工程菌TM3的β-香树脂醇产量达36.2±3.9 mg/L，较已报道菌株提高6倍。进一步开发甲基-β-环糊精（MβCD）添加策略，将疏水性三萜从细胞螯合至培养基以解除产物抑制，使β-香树脂醇总量提高1.6倍，羟基化产物产量提高5.5倍。最终，通过组合表达CYP716Y1、CYP716A12和UGT73C11，成功构建了从2,3-氧化鲨烯到3-O-Glc-棘囊酸的完整合成途径，并经NMR确证C-16α羟基化。该工作为利用酵母平台生产三萜皂苷类活性分子奠定了基础，也证明了大环糊精螯合策略对提升疏水性产物产量的有效性。
创新点
1. 首次鉴定并表征了柴胡属植物中催化三萜C-16α羟基化的P450酶CYP716Y1；2. 建立了利用甲基-β-环糊精将三萜皂苷元从酵母细胞中螯合到培养基的工艺，使产量显著提升；3. 在酵母中实现了从2,3-氧化鲨烯经环化、氧化和糖基化到单糖基化皂苷（3-O-Glc-棘囊酸）的完整合成途径。
研究对象（9）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae (strain BY4742 and derivatives) | 三萜皂苷生物合成通路 | CYP716Y1 | CYP716Y1 | 催化 | 来自Bupleurum falcatum，催化β-香树脂醇和α-香树脂醇C-16α羟基化 |
| Saccharomyces cerevisiae (strain BY4742 and derivatives) | 三萜皂苷生物合成通路 | CYP716A12 | CYP716A12 | 催化 | 来自Medicago truncatula，催化β-香树脂醇C-28多步氧化（生成齐墩果酸） |
| Saccharomyces cerevisiae (strain BY4742 and derivatives) | 三萜皂苷生物合成通路 | GgbAS | β-amyrin synthase (GgbAS) | 催化 | 来自Glycyrrhiza glabra，催化2,3-氧化鲨烯环化生成β-香树脂醇 |
| Saccharomyces cerevisiae (strain BY4742 and derivatives) | 三萜皂苷生物合成通路 | MtbAS | β-amyrin synthase (MtbAS) | 催化 | 来自Medicago truncatula，催化β-香树脂醇合成 |
| Saccharomyces cerevisiae (strain BY4742 and derivatives) | 三萜皂苷生物合成通路 | AtLUS1 | Lupeol synthase (AtLUS1) | 催化 | 来自Arabidopsis thaliana，催化2,3-氧化鲨烯环化生成羽扇豆醇 |
| Saccharomyces cerevisiae (strain BY4742 and derivatives) | 三萜皂苷生物合成通路 | CaDDS | Dammarenediol synthase (CaDDS) | 催化 | 来自Centella asiatica，主要催化生成α-香树脂醇、β-香树脂醇和达玛烯二醇-II |
| Saccharomyces cerevisiae (strain BY4742 and derivatives) | 三萜皂苷生物合成通路 | AtATR1 | Cytochrome P450 reductase (AtATR1) | 能量供给 | 来自Arabidopsis thaliana，为P450提供电子 |
| Saccharomyces cerevisiae (strain BY4742 and derivatives) | 三萜皂苷生物合成通路 | UGT73C11 | UDP-glycosyltransferase UGT73C11 | 催化 | 来自Barbarea vulgaris，催化皂苷元3-O-葡萄糖基化 |
| Saccharomyces cerevisiae (strain BY4742 and derivatives) | 甲羟戊酸途径 | tHMG1 | Truncated 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase | 催化 | 酿酒酵母截短反馈不敏感HMG-CoA还原酶，增强甲羟戊酸途径通量 |
关键发现
- 鉴定出CYP716Y1催化β-香树脂醇和α-香树脂醇的C-16α羟基化，但对羽扇豆醇无活性
- 工程菌TM3产β-香树脂醇达36.2±3.9 mg/L，比已报道菌株提高6倍
- TM2产19±1.0 mg/L
- TM6产羽扇豆醇46.3±2.4 mg/L
- 5 mM MβCD处理使β-香树脂醇总量提高1.6倍，使羟基化β-香树脂醇产量提高5.5倍
- 联合表达CYP716Y1和CYP716A12产生羟基齐墩果醛
- 表达CYP716Y1、CYP716A12、UGT73C11的菌株TM44产生3-O-Glc-棘囊酸和3-O-Glc-齐墩果酸，并通过NMR确证C-16α羟基化。
研究结论
本研究为利用酿酒酵母作为合成生物学平台生产生物活性三萜皂苷元及皂苷奠定了基础，展示了大环糊精螯合策略对提高疏水性产物产量的有效性，并证明了通过组合表达不同植物来源的OSC、P450和UGT基因重构完整皂苷合成途径的可行性。