Tanshinones, Critical Pharmacological Components in Salvia miltiorrhiza

作者: Zhouqian Jiang, Wei Gao, Luqi Huang
单位: School of Traditional Chinese Medicine, Capital Medical University, Beijing, China; School of Pharmaceutical Sciences, Capital Medical University, Beijing, China; State Key Laboratory of Dao-di Herbs, National Resource Center for Chinese Material Medicine, China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing, China
杂志: Frontiers in Pharmacology（2019）
DOI: 10.3389/fphar.2019.00202
所属领域: 合成生物学 / 代谢工程
关键词: 丹参酮丹参（Salvia miltiorrhiza）提取与分离生物合成药理活性
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解决的核心问题

传统提取分离丹参酮的方法效率低、能耗高、污染环境，且野生丹参资源濒危、栽培产量低，难以满足日益增长的临床需求；同时丹参酮生物合成途径尚未完全阐明，需要解析完整途径并利用合成生物学构建高产工程菌株。

研究策略

系统综述丹参酮的组成、提取分离方法、药理活性和生物合成途径；重点介绍MVA和MEP途径中关键酶基因的克隆与功能研究，以及利用酿酒酵母作为底盘细胞，通过模块化途径工程重构丹参酮前体（milttiradiene和ferruginol）的异源生产。

研究路线图

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核心内容

丹参酮是丹参的关键药效成分，但传统提取分离方法效率低、污染大，野生资源濒危且栽培产量不足。该综述系统梳理了丹参酮的组成、提取纯化方法、药理活性及生物合成途径研究进展。在提取方面，总丹参酮粗提物经纯化后含量从18.23%提升至57.29%，半制备型高速逆流色谱可分离四种主要丹参酮且纯度均超95%；药理上丹参酮I抑制人前列腺癌细胞增殖的IC50约为3–6 μM。在合成生物学层面，研究重点解析了MVA和MEP途径中关键酶基因的功能，鉴定了SmCYP76AH1、SmCYP76AH3和SmCYP76AK1等细胞色素P450酶的催化机制。通过模块化途径工程在酿酒酵母中重构丹参酮前体合成，工程菌株在15 L生物反应器中milttiradiene产量达365 mg/L，优化后最高达488 mg/L；异源表达SmCYP76AH1与植物CPR后ferruginol产量达10.5 mg/L。此外，过表达SmHMGR1/2/3或SmGGPPS1可显著提高丹参毛状根中丹参酮含量。这些进展表明合成生物学为丹参酮可持续获取提供了可行路线，但从ferruginol到终产丹参酮的完整途径仍需进一步解析。

创新点

总结了丹参酮生物合成研究的重要进展，特别是细胞色素P450酶（如SmCYP76AH1、SmCYP76AH3、SmCYP76AK1）的鉴定及其催化机制；模块化途径工程在酵母中实现milttiradiene高达488 mg/L和ferruginol达10.5 mg/L的产量；结合代谢组学与转录组学挖掘候选基因。

研究对象（24）

底盘细胞	代谢通路	基因	蛋白	功能	说明
酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）	丹参酮生物合成途径	—	—	—	作为异源生产底盘，通过模块化途径工程表达来自丹参的SmCPS、SmKSL及MVA途径基因，实现milttiradiene的高产（最高488 mg/L）。
丹参（Salvia miltiorrhiza）毛状根	丹参酮生物合成途径	—	—	—	用于研究丹参酮生物合成、基因功能验证及诱导子调控。
丹参	甲羟戊酸（MVA）途径	—	—	—	从乙酰辅酶A合成IPP和DMAPP，对丹参毛状根细胞生长更重要。
丹参	2-C-甲基-D-赤藓醇4-磷酸（MEP）途径	—	—	区室化	定位于质体，为丹参酮合成提供前体，与丹参酮生产更相关。
丹参	MVA途径	SmAACT	乙酰辅酶A C-乙酰转移酶	催化	催化乙酰辅酶A缩合生成乙酰乙酰辅酶A。
丹参	MVA途径	SmHMGS	3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合酶	催化	催化HMG-CoA的合成。
丹参	MVA途径	SmHMGR1-4	3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶	催化	四个同源基因，其中SmHMGR1-3受MeJA诱导，过表达可显著提高丹参酮含量。
丹参	MVA途径	SmMK	甲羟戊酸激酶	催化	催化甲羟戊酸磷酸化。
丹参	MVA途径	SmPMK	磷酸甲羟戊酸激酶	催化	催化磷酸甲羟戊酸进一步磷酸化。
丹参	MVA途径	SmMDC	甲羟戊酸二磷酸脱羧酶	催化	催化甲羟戊酸二磷酸脱羧生成IPP。
丹参	MEP途径	SmDXS2	1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶	催化	在根中表达最高，可能参与丹参酮生物合成。
丹参	MEP途径	SmDXS3	1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶	催化	在根及根茎中高表达，对MeJA敏感，可能参与植物防御。
丹参	MEP途径	SmDXR	1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶	催化	催化DXP还原为MEP；在根中表达最高，受高渗胁迫和酵母诱导子上调。
丹参	萜类前体合成	SmIDI1	异戊烯基二磷酸异构酶	催化	受Ag+和MeJA诱导，可能参与丹参酮生物合成。
丹参	萜类前体合成	SmIDI2	异戊烯基二磷酸异构酶	催化	具有叶绿体定位信号肽，表达水平低于SmIDI1。
丹参	萜类前体合成	SmFPPS	法尼基二磷酸合酶	催化	催化IPP与DMAPP缩合生成FPP。
丹参	萜类前体合成	SmGPPS（同源基因多个）	香叶基二磷酸合酶	催化	包括同源和异源亚基，参与单萜及部分二萜前体合成。
丹参	二萜前体合成	SmGGPPS1	香叶基香叶基二磷酸合酶	催化	催化FPP与IPP缩合生成GGPP；过表达可显著提高丹参酮含量，SmGGPPS2/3功能待研究。
酿酒酵母	milttiradiene分支途径	SmCPS1	柯巴基二磷酸合酶	催化	与SmKSL1共同催化GGPP环化生成milttiradiene；在酵母中表达用于高产生产。
酿酒酵母	milttiradiene分支途径	SmKSL1	贝壳杉烯合酶类似蛋白	催化	与SmCPS1合作，参与milttiradiene的合成。
酿酒酵母	丹参酮后修饰途径	SmCYP76AH1	细胞色素P450氧化酶	催化	催化milttiradiene氧化为ferruginol；在酵母中与CPR共表达时ferruginol产量达10.5 mg/L。
丹参	丹参酮后修饰途径	SmCYP76AH3	细胞色素P450氧化酶	催化	氧化ferruginol生成11-羟基ferruginol和11-羟基sugiol。
丹参	丹参酮后修饰途径	SmCYP76AK1	细胞色素P450氧化酶	催化	羟基化C-20，与CYP76AH3协同生成11,20-二羟基ferruginol等中间体。
丹参	丹参酮后修饰途径	SmCPR1/SmCPR2	细胞色素P450还原酶	能量供给	为P450酶提供电子，是P450催化活性所必需的伴侣蛋白。

关键发现

总丹参酮粗提物经纯化后含量从18.23%提高到57.29%
半制备型高速逆流色谱（HSCCC）分离四种主要丹参酮成分纯度均超过95%
丹参酮I抑制人前列腺癌细胞增殖的IC50约为3-6 μM
通过模块化途径工程，工程酿酒酵母菌株在15 L生物反应器中milttiradiene产量达365 mg/L，优化后最高产量达488 mg/L
在酵母中异源表达SmCYP76AH1与植物CPR，摇瓶发酵ferruginol最高产量达10.5 mg/L
过表达SmHMGR1/2/3或SmGGPPS1可显著提高丹参毛状根中丹参酮含量
SmCYP76AH3与SmCYP76AK1连续催化可将ferruginol转化为11,20-二羟基ferruginol等中间体。

研究结论

丹参酮是丹参的关键药理活性成分，具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤及心血管保护等多种作用。传统提取方法难以满足临床需求，合成生物学为丹参酮的可持续获取提供了新策略。目前已在酿酒酵母中实现关键中间体milttiradiene和ferruginol的异源高效生产，但从ferruginol到终产丹参酮的完整途径仍需进一步解析，未来需发现更多功能基因并重构完整生物合成通路。