高级醇 · 代谢工程文献库

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Probing the promiscuity of ent-kaurene oxidases via combinatorial biosynthesis

作者
Sibongile Mafu, Meirong Jia, Jiachen Zi, Dana Morrone, Yisheng Wu, Meimei Xu, Matthew L. Hillwig, Reuben J. Peters
单位
Roy J. Carver Department of Biochemistry, Biophysics & Molecular Biology, Iowa State University, Ames, IA 50011
杂志
PNAS（2016）
DOI
10.1073/pnas.1512096113
所属领域
合成生物学
关键词
cytochrome P450 monooxygenasesenzyme specificitygibberellinslabdane-related diterpenoidsnatural products
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解决的核心问题

天然产物代谢酶底物特异性的研究常受限于底物和产物标准品的可获得性，本文旨在通过组合生物合成方法系统研究ent-kaurene氧化酶（KO）的底物混杂性，并揭示其结构-功能关系。

研究策略

利用模块化代谢工程系统，在大肠杆菌中组合表达来自不同来源的二萜合酶和KO（AtKO或OsKO2）及其配套的细胞色素P450还原酶，构建产生超过20种labdane相关二萜烯（LRD）的菌株，通过GC-MS筛选底物混杂性，并通过NMR解析未知产物结构，结合相对动力学和分子进化分析。

研究路线图

100%
研究问题：KO酶底物混杂性不明
策略：组合生物合成系统
关键改造：大肠杆菌异源表达
结果：20+ LRD产物生成及鉴定
结果：动力学及产物选择性差异
结果：分子进化及选择压力分析
结论：组合生物合成揭示底物混杂性
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核心内容

该研究利用组合生物合成策略在大肠杆菌中系统探究了ent-kaurene氧化酶（KO）的底物混杂性。作者将来自拟南芥的AtKO和来自水稻的OsKO2分别与多种二萜合酶及配套的细胞色素P450还原酶组合表达，构建了可产生超过20种labdane相关二萜烯（LRD）的菌株文库，并通过GC-MS筛选底物谱、NMR解析新产物结构。结果显示AtKO表现出广泛的底物混杂性，能够氧化超过20种LRD，而OsKO2仅接受ent-kaurene等三种底物。动力学测定表明，AtKO对替代底物的KM为30–50 μM，比天然底物ent-kaurene的2 μM高一个数量级以上，催化效率降低至少两个数量级。结构解析揭示了AtKO对ent-CPP衍生底物主要氧化C4α甲基，对normal/syn-CPP衍生底物则氧化C3β或C2α位。分子进化分析显示水稻CYP701A旁系同源基因的约25%位点放松了纯化选择（ω=0.44 vs 0.12）。该工作证明了组合生物合成是解析复杂代谢酶底物特异性的有效手段，AtKO的混杂性也为二萜类化合物的生物技术改造提供了潜在资源。

创新点

将组合生物合成应用于酶底物特异性的发现与表征；首次系统比较了拟南芥AtKO和水稻OsKO2的底物选择性；解析了12个新产物的结构；揭示了AtKO对LRD底物的混杂性及其结构基础。

研究对象（4）

底盘细胞代谢通路基因蛋白功能说明
Escherichia coli labdane-related diterpenoid (LRD) 生物合成 CYP701A3 AtKO 催化 拟南芥ent-kaurene氧化酶，底物混杂性广泛
Escherichia coli labdane-related diterpenoid (LRD) 生物合成 CYP701A6 OsKO2 催化 水稻ent-kaurene氧化酶，底物特异性严格
Escherichia coli 细胞色素P450还原 AtCPR1 AtCPR1 能量供给 拟南芥NADPH-细胞色素P450还原酶，为AtKO提供电子
Escherichia coli 细胞色素P450还原 OsCPR1 OsCPR1 能量供给 水稻NADPH-细胞色素P450还原酶，为OsKO2提供电子

关键发现

  1. ['AtKO表现出广泛的底物混杂性，可作用于超过20种LRD，而OsKO2仅与ent-kaurene、ent-isokaurene和ent-trachylobane反应。', 'AtKO对替代底物的KM为30-50 μM，比天然底物ent-kaurene的KM（2 μM）高10倍以上；Vmax约为ent-kaurene的1/10，催化效率降低至少两个数量级。', 'AtKO对ent-CPP衍生的LRD主要氧化C4α甲基，对normal/syn-CPP衍生的LRD主要氧化C3β或C2α位。', '动力学数据：ent-cassadiene KM=50±7 μM，相对Vmax
  2. 14；ent-sandaracopimaradiene KM=46±24 μM，相对Vmax
  3. 11；syn-aphidicolene KM=50±14 μM，相对Vmax
  4. 12；isopimara-7,15-diene KM=30±8 μM，相对Vmax
  5. 11。', '分子进化分析表明水稻CYP701A旁系同源基因受到不同的选择压力，ω=0.44 vs 其余家族成员0.12，P<0.001，约25%的位点放松了纯化选择。']

研究结论

AtKO表现出广泛的底物混杂性，而OsKO2具有严格的底物特异性，这种差异可能与植物代谢背景和进化选择压力有关。组合生物合成是研究复杂天然产物代谢酶底物特异性的有效方法，且AtKO的混杂性具有潜在的工业生物技术应用价值。