Artemisia annua mutant impaired in artemisinin synthesis demonstrates importance of nonenzymatic conversion in terpenoid metabolism
- 作者
- Tomasz Czechowski, Tony R. Larson, Theresa M. Catania, David Harvey, Geoffrey D. Brown, Ian A. Graham
- 单位
- Centre for Novel Agricultural Products, Department of Biology, University of York; Department of Chemistry, University of Reading
- 杂志
- Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America (PNAS)（2017）
- DOI
- 10.1073/pnas.1611567113
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
解析青蒿素生物合成最终步骤是否为酶促过程，以及敲除CYP71AV1后阻断青蒿素合成对倍半萜代谢流的影响，并探究腺毛分泌腔在非酶促转化中的功能。
研究策略
利用TILLING筛选CYP71AV1敲除突变体cyp71av1-1，通过比较野生型与突变体不同叶龄的代谢物谱，结合NMR鉴定新化合物，并采用13C标记的二氢青蒿酸饲喂完整腺毛及蛋白提取物，验证最终转化步骤的非酶促性质。
核心内容
该研究通过TILLING技术获得黄花蒿CYP71AV1功能缺失突变体cyp71av1-1，该基因第二个外显子发生G→A突变（Trp-124→终止密码子），导致青蒿素合成完全阻断，底物amorpha-4,11-二烯显著积累。代谢物谱分析显示，突变体成熟叶片中积累新倍半萜环氧化物arteannuin X，含量达0.4%叶干重，约为野生型青蒿素最高积累量（1.2%叶干重）的三分之一。通过13C标记二氢青蒿酸饲喂完整腺毛及蛋白提取物，发现5天内未检测到标记青蒿素积累，而DHEDB在光照条件下形成，煮沸加速、黑暗抑制该过程，证明青蒿素生物合成中二氢青蒿酸至青蒿素的最终步骤为非酶促转化，且依赖腺毛亚顶端腔的非水环境；在水相环境中代谢流转向生成DHEDB。该研究首次报道CYP71AV1敲除突变体，揭示黄花蒿腺毛代谢具有高度可塑性，可通过代谢流改向高效生成新型倍半萜化合物，表明植物腺毛可作为优于微生物宿主的天然倍半萜生产工厂。
创新点
首次报道CYP71AV1功能缺失突变体cyp71av1-1；发现新倍半萜环氧化物arteannuin X，其积累量接近野生型青蒿素水平；提供体内证据证明DHAA至青蒿素的最终步骤为非酶促转化，且需要腺毛亚顶端腔的非水环境；展示植物腺毛代谢可塑性及作为新型倍半萜生产工厂的潜力。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Artemisia annua (黄花蒿) 腺毛分泌细胞 | 青蒿素生物合成（倍半萜内酯） | CYP71AV1 | amorpha-4,11-二烯C-12氧化酶（CYP71AV1） | 催化 | 催化A-4,11-D经三步氧化生成青蒿酸；cyp71av1-1突变体为功能缺失突变（Trp-124→终止），导致青蒿素完全丧失，并积累arteannuin X。 |
| Artemisia annua (黄花蒿) | 青蒿素生物合成 | ADS (AMORPHA-4,11-DIENE SYNTHASE) | amorpha-4,11-二烯合酶 | 催化 | 催化FPP环化形成A-4,11-D，为青蒿素途径的第一限速步骤；论文在通路背景中提及，并非直接研究对象。 |
| Artemisia annua (黄花蒿) 腺毛蛋白提取物 | 青蒿素生物合成（下游非酶促转化） | — | 无特定蛋白（非酶促过程） | 催化 | 13C-DHAA饲喂实验证明DHAA至DHEDB的转化是非酶促、需光照的过程；煮沸加速反应，暗示非酶本质。 |
关键发现
- ['cyp71av1-1突变体因CYP71AV1第二个外显子G→A突变（Trp-124→终止密码子）导致酶功能丧失，青蒿素合成完全阻断，amorpha-4,11-二烯（A-4,11-D）显著积累。', '突变体成熟叶片中积累新倍半萜环氧化物arteannuin X，含量达0.4%叶干重，约为野生型青蒿素（最高1.2%叶干重）的一半。', 'A-4,11-DOOH（A-4,11-D叔烯丙基氢过氧化物）在突变体幼叶和伸展叶中积累至约0.15%叶干重，随后降低，并自发转化为arteannuin X。', '野生型中DHAAOOH在伸展叶达峰值0.5%叶干重
- 青蒿素在成熟叶中最大积累为1.2%叶干重，收获后干燥过程中保持稳定。', 'DHEDB浓度比青蒿素低3倍
- 脱氧青蒿素在干燥储存期间积累至0.1%叶干重，提示剩余DHAAOOH优先转化为脱氧青蒿素。', '13C标记DHAA饲喂完整腺毛及蛋白提取物：5天内未检测到标记青蒿素积累，而DHEDB在光照条件下积累，2-3天达平台
- 煮沸加速DHEDB形成，黑暗抑制，表明该过程为非酶促且依赖光照。', '非水环境（如腺毛亚顶端腔）对DHAA经DHAAOOH高效转化为青蒿素至关重要
- 在水相环境中DHAA转向形成DHEDB。']
研究结论
青蒿素生物合成中DHAA到青蒿素的最终步骤在体内为非酶促转化，依赖腺毛亚顶端腔的非水环境；CYP71AV1敲除导致代谢流改向，高效生成新倍半萜arteannuin X，证明黄花蒿腺毛代谢具有高度可塑性，可作为生产新型倍半萜化合物的天然工厂，优于缺乏区室化结构的微生物宿主。