Diversifying Isoprenoid Platforms via Atypical Carbon Substrates and Non-model Microorganisms
- 作者
- David N. Carruthers, Taek Soon Lee
- 单位
- Joint BioEnergy Institute, Emeryville, CA, United States; Biological Systems and Engineering Division, Lawrence Berkeley National Laboratory, Berkeley, CA, United States
- 杂志
- Frontiers in Microbiology（2021）
- DOI
- 10.3389/fmicb.2021.791089
- 所属领域
- 代谢工程/合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
传统微生物底盘（如大肠杆菌和酿酒酵母）在异戊二烯商业化生产中面临糖底物成本高、前体通量受限、中间产物反馈抑制等障碍，且非模式微生物虽有独特的碳源利用和耐受特性但遗传工具匮乏，如何协同模型与非模型微生物利用非典型碳底物（如C1化合物、木质纤维素）提高异戊二烯生产的商业可行性。
研究策略
系统综述近年异戊二烯生物合成进展，重点分析古菌MVA通路新发现、合成旁路（C5醇利用、IPK旁路、nDXP分流等）、细胞色素P450功能化、以及甲基营养菌、光合微生物、产油酵母和土壤细菌等非模式微生物在C1底物和木质纤维素利用上的工程化策略，强调模型与非模型微生物间的经验互通。
核心内容
该文系统综述了利用非典型碳底物和非模式微生物拓宽异戊二烯类化合物生产平台的最新进展。作者重点分析了古菌MVA通路的三种新分支及其关键酶如异戊烯磷酸激酶和磷酸甲羟戊酸脱羧酶的应用，提出了通过C5醇喂养和IPK表达实现生长解偶联的生产策略，并扩展了异戊二烯碳骨架的非常规长度规则。在非模式微生物方面，综述涵盖了甲基营养菌、光合微生物、产油酵母和产甲烷古菌等在甲醇或木质纤维素底物上的工程化进展，其中包括M. extorquens以甲醇生产α-葎草烯达1.65 g/L的最高报道产量，以及P. pastoris以甲醇生产番茄红素714 mg/L等代表性数据。此外，文章还总结了通过IPK旁路和prenol添加使β-胡萝卜素产量提高97%、利用nDXP分流使双没药烯产量提高4倍等关键成果。该综述表明，挖掘古菌新酶、构建合成旁路并利用能代谢C1底物的非模式微生物，可显著提升异戊二烯生产的碳源经济性和产量，但非模式微生物遗传工具匮乏仍是主要瓶颈，模型与非模式微生物间的经验互鉴将推动该领域的商业化进程。
创新点
总结了古菌MVA通路三种分支（haloarchaea型、thermoplasma型和古菌保守型）及新型酶（如IPK、PMD）的应用；提出了通过C5醇喂养和IPK表达实现生长解偶联的异戊二烯生产；扩展了异戊二烯碳骨架规则（C11、C16、C17等非常规长度）；梳理了非模式微生物（如甲基营养菌、光合微生物、产油酵母）在C1原料上的生产进展。
研究对象（17）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli | MEP pathway | dxs, idi, ispG, ispH | DXS, IDI, IspG, IspH | 催化 | MEP途径关键酶，用于异戊二烯和类胡萝卜素生产，IspG/IspH平衡表达可提高β-胡萝卜素和α-番茄红素产量 |
| Escherichia coli | MVA pathway (heterologous) | atoB, HMGS, HMGR, PMK, PMD, IDI | AtoB, HMGS, HMGR, PMK, PMD, IDI | 催化 | 异源MVA途径，用于生产青蒿二烯、异戊烯醇等，通过反馈抑制抗性突变和基因平衡优化 |
| Saccharomyces cerevisiae | MVA pathway | ERG20, tHMG1, IDI1 | FPP合酶, HMG-CoA还原酶, IPP异构酶 | 催化 | 酿酒酵母内源MVA途径，用于生产青蒿酸、大麻素、人参皂苷等 |
| Saccharomyces cerevisiae | MVA pathway (archaeal-inspired) | IPK, PMD | 异戊烯磷酸激酶, 磷酸甲羟戊酸脱羧酶 | 催化 | 通过表达古菌IPK和突变PMD，构建IPP旁路，实现异戊烯醇10.8 g/L的最高产量 |
| Methylorubrum extorquens AM1 | Serine cycle / ethylmalonyl-CoA pathway | MVA pathway genes from Myxococcus xanthus, FPP synthase, α-humulene synthase | HMGS, HMGR, FPP合酶, α-葎草烯合酶 | 催化 | 以甲醇为唯一碳源，通过异源表达MVA途径和α-葎草烯合酶，实现α-葎草烯产量1.65 g/L |
| Pichia pastoris (Komagataella phaffii) | Xylulose monophosphate (XuMP) cycle / methanol assimilation | AOX1 | 醇氧化酶 | 催化 | 甲醇诱导的AOX1驱动甲醇代谢，结合异源途径生产番茄红素714 mg/L和(+)-nootkatone 208 mg/L |
| Methanosarcina acetivorans | Methanogenesis / MVA pathway (archaeal) | ispS | 异戊二烯合酶 | 催化 | 厌氧条件下以甲醇为底物生产异戊二烯，异戊二烯占总碳通量4%，产量0.954 mM/L |
| Synechococcus elongatus | MEP pathway / Calvin-Benson-Bassham cycle | dxs, idi, ispA, ispS | DXS, IDI, FPP合酶, 异戊二烯合酶 | 催化 | 光合自养生产异戊二烯，通过过表达MEP酶和异源异戊二烯合酶达到1.26 g/L（数周培养） |
| Synechocystis sp. PCC 6803 | MEP pathway / CBB cycle | idi, dxs, ispA, bisabolene synthase | IDI, DXS, FPP合酶, 双没药烯合酶 | 催化 | 通过碳汇工程和异源双没药烯合酶表达，提高双没药烯产量 |
| Yarrowia lipolytica | MVA pathway / oleaginous metabolism | CYP716A12, CPR, limonene synthase | CYP716A12, 细胞色素P450还原酶, 柠檬烯合酶 | 催化 | 产油酵母，利用木质纤维素或废弃油脂生产柠檬烯、诺卡酮和桦木酸等 |
| Rhodosporidium toruloides | MVA pathway / lignocellulose degradation | terpene synthases, CYP450s | 萜烯合酶, 细胞色素P450 | 催化 | 能够降解木质纤维素中的芳香族化合物，用于生产萜烯生物燃料 |
| Pseudomonas putida KT2440 | MEP pathway / aromatic compound degradation | dxs, idi, mevalonate pathway genes | DXS, IDI, HMGS, HMGR | 催化 | 土壤细菌，天然耐受木质纤维素水解液中的芳香族抑制剂，可工程化生产甲羟戊酸和萜烯 |
| Bacillus subtilis | MEP pathway / MVA pathway (heterologous) | amorphadiene synthase, squalene synthase | 无定形二烯合酶, 角鲨烯合酶 | 催化 | 革兰氏阳性模式菌，通过CRISPR-Cas9多模块工程提高无定形二烯和角鲨烯产量 |
| Escherichia coli | Synthetic IPP-bypass pathway | IPK (Thermoplasma acidophilum), phoN | 异戊烯磷酸激酶, 磷酸酶PhoN | 催化 | 通过表达IPK和磷酸酶，从C5醇（异戊烯醇/异戊醇）直接生成IPP/DMAPP，实现生长解偶联的番茄红素生产（190 mg/L） |
| Escherichia coli | MEP pathway (nDXP shunt) | yajO, ribB (mutant), xylulose kinase | YajO, RibB突变体, 木酮糖激酶 | 催化 | 通过D-核酮糖-5-磷酸分流提高碳效率，使MEP来源的双没药烯产量提高4倍 |
| Escherichia coli | Cytochrome P450 functionalization | CYP71AV1, aaCPR, CYP725A4, tcCPR | CYP71AV1, 青蒿酸氧化酶, 细胞色素P450还原酶, CYP725A4, 紫杉二烯氧化酶 | 催化 | 异源表达植物CYP和还原酶，用于生产青蒿酸（5.8 mg/L）和含氧紫杉烷（570 mg/L） |
| Saccharomyces cerevisiae | Cannabinoid biosynthesis (meroterpenoid) | csPT4, THCA synthase, CBDA synthase | 大麻素前体异戊烯转移酶, 四氢大麻酚酸合酶, 大麻二酚酸合酶 | 催化 | 在酵母中实现大麻素及其非天然类似物的完全生物合成 |
关键发现
- 综述中报道的关键数据包括：异戊烯醇最高产量10.8 g/L（Kang et al., 2019）
- 通过表达T. acidophilum IPK并添加2 mM prenol可使β-胡萝卜素产量提高45%，经定点突变后提高97%
- 利用IPK旁路和2.5 mM prenol/isoprenol混合物生产番茄红素，产量接近190 mg/L
- M. extorquens AM1以甲醇为底物经补料分批发酵生产α-葎草烯达1.65 g/L，为报道最高
- P. pastoris以甲醇生产番茄红素714 mg/L、(+) -nootkatone 208 mg/L
- M. acetivorans以甲醇厌氧生产异戊二烯0.954 mM/L，M. barkeri为36.0 μM/L
- 在S. cerevisiae中工程化CYP716A47获得原人参二醇11.02 g/L
- 在E. coli中含氧紫杉烷产量570 mg/L
- 利用nDXP分流使双没药烯产量提高4倍
- 通过CYP71AV1在S. cerevisiae中生产青蒿酸100 mg/L。
研究结论
通过挖掘古菌MVA通路的新酶、构建合成旁路、以及利用甲基营养菌、光合微生物、产油酵母和非模式细菌等能够代谢C1底物或耐受有毒底物的微生物，可以显著拓宽异戊二烯生产的碳源经济性并提高产量，但非模式微生物的遗传工具仍需进一步开发，模型与非模式微生物之间的相互借鉴将推动异戊二烯平台的商业化。