Isolation of an Arabidopsis thaliana gene encoding cycloartenol synthase by functional expression in a yeast mutant lacking lanosterol synthase by the use of a chromatographic screen
- 作者
- E. J. Corey, Seiichi P. T. Matsuda, Bonnie Bartel
- 单位
- Department of Chemistry, Harvard University; Whitehead Institute for Biomedical Research
- 杂志
- Proceedings of the National Academy of Sciences（1993）
- DOI
- 10.1073/pnas.90.24.11628
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
植物环阿屯醇合酶难以从粗提物中纯化，且植物中存在多种环氧角鲨烯环化酶，无法通过互补代谢突变克隆，需要一种不需纯化蛋白的克隆方法。
研究策略
采用缺乏羊毛甾醇合酶的酵母突变株SMY1作为宿主，转化拟南芥cDNA表达文库，通过TLC色谱法直接检测转化子匀浆中能否将2,3-环氧角鲨烯环化为环阿屯醇，从而分离目标基因。
核心内容
该研究针对植物环阿屯醇合酶难以通过传统蛋白纯化或代谢互补方法克隆的问题，建立了一种基于薄层色谱（TLC）的功能筛选策略。研究者以缺乏羊毛甾醇合酶的酿酒酵母突变株SMY1为宿主，转化拟南芥cDNA表达文库，直接检测转化子匀浆中能否将2,3-环氧角鲨烯环化为环阿屯醇。从约10,000个转化子中筛得一个阳性池，进而分离出三个单菌落，其中质粒pSM60携带的CAS1基因编码一个86 kDa蛋白，开放阅读框长2277 bp。酶促反应以(±)-2,3-环氧角鲨烯为底物获得3.8 mg环阿屯醇，产率达79%（基于S型异构体）。序列分析显示该蛋白与白色念珠菌羊毛甾醇合酶及嗜酸芽孢杆菌角鲨烯-藿烯环化酶显著同源。该工作首次将TLC色谱筛选应用于环氧角鲨烯环化酶基因克隆，无需纯化蛋白即可从异源表达文库中直接鉴定目标基因，为其他次级代谢产物合成基因的克隆提供了可推广的通用策略。
创新点
首次建立了基于TLC的色谱筛选法用于克隆环氧角鲨烯环化酶基因；该方法无需纯化蛋白或代谢突变互补，可普遍适用于次级代谢产物合成基因的克隆。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 拟南芥 (Arabidopsis thaliana) | 甾醇生物合成 | CAS1 | 环阿屯醇合酶 (cycloartenol synthase, EC 5.4.99.8) | 催化 | 基因来源植物，其叶片含约2.3 kb CAS1转录本 |
| 酿酒酵母 SMY1 (erg7缺失突变株) | 甾醇生物合成 | CAS1（外源） | 环阿屯醇合酶 | 催化 | 异源表达宿主，缺乏羊毛甾醇合酶以消除背景活性 |
| 酿酒酵母 GL7 (erg7突变株) | 甾醇生物合成 | ERG7（缺失） | 羊毛甾醇合酶 (lanosterol synthase) | 催化 | 用于构建SMY1的母本菌株 |
| 白色念珠菌 (Candida albicans) | 甾醇生物合成 | ERG7 | 羊毛甾醇合酶 | 催化 | 序列同源性比较 |
| 嗜酸芽孢杆菌 (Bacillus acidocalcarius) | 萜类生物合成 | SHC | 角鲨烯-藿烯环化酶 (squalene-hopene cyclase) | 催化 | 序列同源性比较 |
关键发现
- 从约10,000个酵母转化子中筛到1个阳性池，再分离到3个单菌落
- 质粒pSM60含CAS1基因，开放阅读框2277 bp，编码86 kDa蛋白
- 叶片RNA有约2.3 kb的杂交条带，说明cDNA全长
- 酶促反应从(±)-2,3-环氧角鲨烯获得3.8 mg环阿屯醇，产率79%（基于S-型环氧角鲨烯）
- 序列与白色念珠菌羊毛甾醇合酶和嗜酸芽孢杆菌角鲨烯-藿烯环化酶显著同源。
研究结论
成功克隆了拟南芥CAS1基因编码环阿屯醇合酶，并在酵母中异源表达验证功能；该TLC筛选策略可推广至其他次级代谢产物基因的克隆。