Cytoplasmic inhibition of carotenoid biosynthesis with virus-derived RNA
- 作者
- M. H. KUMAGAI, J. DONSON, G. DELLA-CIOPPA, D. HARVEY, K. HANLEY, L. K. GRILL
- 单位
- Biosource Technologies, 3333 Vaca Valley Parkway, Vacaville, CA 95688
- 杂志
- Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America（1995）
- DOI
- 10.1073/pnas.92.5.1679
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
如何利用RNA病毒载体在植物细胞质中操纵类胡萝卜素生物合成途径，并验证细胞质中产生的反义RNA能否抑制内源基因表达。
研究策略
构建基于TMV-U1和ToMV-F序列的杂合病毒载体TTO1，将番茄PSY正义cDNA和PDS反义cDNA置于亚基因组启动子控制下，通过体外转录感染本氏烟草，结合表型观察、HPLC定量八氢番茄红素和RT-PCR分析验证调控效果。
核心内容
本研究构建了基于烟草花叶病毒U1株和番茄花叶病毒F序列的杂合病毒载体TTO1，将番茄PSY正义cDNA或PDS反义cDNA置于亚基因组启动子控制下，通过体外转录感染本氏烟草，在细胞质中操纵类胡萝卜素生物合成途径。转染TTO1/PSY+的植株叶片呈亮橙色，八氢番茄红素含量达52.4 μg/g鲜重，较未转染对照（4.6 μg/g）提高11.4倍；转染TTO1/PDS-的植株叶片和花萼白化，八氢番茄红素积累至234.8 μg/g，提高51.0倍，接近除草剂norflurazon处理组水平。RT-PCR分析显示，反义PDS转化植株中内源PDS mRNA无法检出，而病毒来源的番茄反义RNA正常存在，证实细胞质中反义RNA通过双链RNA机制降解内源转录本。本氏烟草与番茄PDS对应区域同源性达92%，保证了异源抑制效果。该工作首次证明RNA病毒载体可在植物细胞质中有效操控真核生物合成途径，为植物代谢工程和基因功能研究提供了新工具。
创新点
首次利用自主复制的RNA病毒载体在植物细胞质中操纵真核生物合成途径；证明了细胞质中表达的反义RNA可有效抑制内源基因（PDS）表达；构建了可高效递送外源基因的杂合病毒载体TTO1。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Nicotiana benthamiana (本氏烟草) | 类胡萝卜素生物合成途径 | PSY (phytoene synthase) | 八氢番茄红素合酶 (PSY) | 催化 | 来自番茄的PSY基因正义表达，促进八氢番茄红素合成，导致叶片亮橙色表型。 |
| Nicotiana benthamiana (本氏烟草) | 类胡萝卜素生物合成途径 | PDS (phytoene desaturase) | 八氢番茄红素脱氢酶 (PDS) | 催化 | 来自番茄的PDS部分cDNA以反义方向表达，抑制内源PDS基因，阻断类胡萝卜素下游合成，使叶片白化并积累八氢番茄红素。 |
| Nicotiana benthamiana (本氏烟草) | 类胡萝卜素生物合成途径 | 内源PDS (phytoene desaturase) | 八氢番茄红素脱氢酶 (PDS) | 催化 | 本氏烟草内源PDS基因被病毒来源的反义RNA抑制，转录水平降低，导致八氢番茄红素积累。 |
关键发现
- 转染TTO1/PSY+的植株叶片呈现亮橙色表型，八氢番茄红素含量为52.4 μg/g鲜重，比未转染植株（4.6 μg/g）提高11.4倍
- 转染TTO1/PDS-的植株叶片和花萼白化，八氢番茄红素积累至234.8 μg/g，提高51.0倍，接近norflurazon处理组（339.8 μg/g，73.9倍）
- 转染TTO1/PSY-仅为1.0 μg/g（0.2倍）。本氏烟草PDS与番茄PDS对应区域（369 bp）核苷酸序列同源性为92%
- 转染TTO1/PDS-的植株中内源PDS mRNA无法通过RT-PCR检测到，而病毒来源的番茄PDS反义RNA可正常检出。
研究结论
RNA病毒载体能够刻意操纵植物类胡萝卜素生物合成途径，通过表达PSY或反义PDS均可显著提高八氢番茄红素含量；病毒来源的反义RNA在细胞质中通过形成双链RNA降解内源mRNA，有效抑制基因表达。该策略为植物代谢工程和基因功能研究提供了新工具。