Isolation and bacterial expression of a sesquiterpene synthase cDNA clone from peppermint (Mentha x piperita, L.) that produces the aphid alarm pheromone (E)-β-farnesene
- 作者
- JOHN CROCK, MARK WILDUNG, RODNEY CROTEAU
- 单位
- Institute of Biological Chemistry, and Department of Biochemistry and Biophysics, Washington State University, Pullman, WA 99164-6340
- 杂志
- Proceedings of the National Academy of Sciences（1997）
- DOI
- 10.1073/pnas.94.24.12833
- 所属领域
- 代谢工程/合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
克隆并表达薄荷中负责合成蚜虫报警信息素(E)-β-法尼烯的倍半萜合酶基因，为通过转基因植物增强害虫抗性提供工具。
研究策略
从薄荷油腺细胞富集cDNA文库中随机测序，筛选到与已知植物萜类合酶相似的p43克隆，转入大肠杆菌进行异源表达，并通过放射性底物和GC-MS/GC-MS分析表征重组酶的产物与动力学参数。
核心内容
该研究从薄荷油腺细胞构建的富集cDNA文库中随机测序，筛选到一个与已知植物萜类合酶高度同源的p43克隆，并将其转入大肠杆菌进行异源表达。重组蛋白经放射性底物 assay 及GC-MS表征，确认为(E)-β-法尼烯合酶，cDNA全长1959 bp，编码550个氨基酸，含典型DDXXD基序。以法尼基焦磷酸为底物时，Mg²⁺为辅因子下产物含85% (E)-β-法尼烯、8% (Z)-β-法尼烯及5% δ-杜松烯；改用Mn²⁺后产物纯度提升至98%，且酶对Mn²⁺的Km约为7 μM，远低于对Mg²⁺的150 μM，显示金属辅因子可显著改变产物特异性和催化效率。该酶还能接受C10底物牻牛儿基焦磷酸，产生柠檬烯（48%）、萜品油烯（15%）等单萜，但对C20底物无活性。薄荷精油中该信息素约占2.9-3.4%。此工作首次克隆并功能表达了薄荷(E)-β-法尼烯合酶，证明其适合通过基因工程在非产萜植物中表达，为利用蚜虫报警信息素和天敌引诱特性增强作物抗虫性提供了关键元件。
创新点
首次从薄荷中克隆并功能表达(E)-β-法尼烯合酶cDNA；发现金属辅因子能显著改变产物特异性（Mn2+使产物纯度提高到98%）；证明该酶能接受C10底物GDP并产生多种单萜。
研究对象（2）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 大肠杆菌 XL1-Blue (Escherichia coli XL1-Blue) | 倍半萜生物合成 (FDP → (E)-β-farnesene) | p43 cDNA (GenBank accession AF024615) | (E)-β-farnesene synthase | 催化 | 重组表达，Mg2+辅因子下产物85% (E)-β-farnesene，Mn2+辅因子下产物98% (E)-β-farnesene |
| 薄荷 (Mentha x piperita) 油腺分泌细胞 | 倍半萜烯生物合成 | 油腺cDNA文库中同源合酶基因 | 内源(E)-β-farnesene synthase | 催化 | 细胞自由提取物可催化FDP生成倍半萜烯，包括石竹烯、γ-杜松烯等 |
关键发现
- 重组酶以Mg2+为辅因子时，产物含85% (E)-β-farnesene、8% (Z)-β-farnesene、5% δ-cadinene
- 以Mn2+为辅因子时含98% (E)-β-farnesene和2% (Z)-β-farnesene。对底物FDP的Km≈0.6 μM，Vrel=100
- 对GDP的Km=1.5 μM，Vrel=3
- Mg2+的Km≈150 μM，Mn2+的Km≈7 μM，Mn2+辅因子下Vrel=80。重组酶对C20底物GGPP无活性，但对C10底物GDP产生limonene (48%)、terpinolene (15%)、myrcene (15%)等。cDNA插入片段长1,959 bp，编码550个氨基酸，蛋白分子量63.8 kDa，含DDXXD基序。薄荷精油倍半萜烯组分中(E)-β-farnesene约占2.9-3.4%。
研究结论
该(E)-β-farnesene合酶具有典型植物倍半萜合酶的特征（细胞质定位、pH最适6.75-7.25、依赖二价金属离子），适合通过基因工程在非产倍半萜植物中表达，利用其蚜虫报警信息素活性与天敌引诱特性改善作物抗虫性。