Plant terpenoid synthases: Molecular biology and phylogenetic analysis
- 作者
- JORG BOHLMANN, GILBERT MEYER-GAUEN, RODNEY CROTEAU
- 单位
- Institute of Biological Chemistry, Washington State University, Pullman, WA 99164-6340; Human Genetics Center, University of Texas, Houston, TX 77225
- 杂志
- Proceedings of the National Academy of Sciences（1998）
- DOI
- 10.1073/pnas.95.8.4126
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
系统综述植物来源的单萜、倍半萜和二萜合成酶（萜类环化酶）的酶学机制、分子克隆、异源表达、序列相关性及系统发育关系，并探讨其生物学功能与生物技术应用。
研究策略
以综述形式整合三类萜类合成酶（C10/C15/C20）的催化机理、生化特性、基因克隆策略（反向遗传、PCR、突变体筛选等），基于33个Tps基因家族成员进行系统发育重建，并比较保守结构域与活性位点。
核心内容
该综述系统梳理了植物单萜、倍半萜和二萜合成酶的酶学机制、基因克隆与异源表达策略，并对33个萜类合成酶基因家族成员进行系统发育重建，将其划分为Tpsa至Tpsf六个亚家族。研究发现，植物萜类合成酶cDNA编码550至850个氨基酸，单萜合酶通常比倍半萜合酶大50至70个氨基酸，二萜合酶则比单萜合酶长约210个氨基酸；保守的DDxxD基序对催化至关重要，将柠檬烯合酶中该基序的任一 Asp 突变为 Ala 或 Glu 可使活性降低1000倍。功能表征显示，巨冷杉的δ-蛇床烯合酶可产生34种倍半萜产物，γ-蛇麻烯合酶产生52种产物，而(-)-蒎烯合酶按2:3比例生成α-蒎烯和β-蒎烯；重组柠檬烯合酶的产物组成与天然酶完全一致。此外，单萜合酶mRNA在机械损伤后2小时开始积累，2至4天达到峰值。研究确立了萜类合成酶的共同进化起源及裸子与被子植物分化后独立演化产生功能多样性的图景，为基于结构信息的酶理性改造和萜类化合物生物技术生产奠定了基础。
创新点
首次对33个植物萜类合成酶进行系统发育分析，将其划分为Tpsa~Tpsf六个亚家族；揭示了不同亚家族的结构差异和进化关系；总结了保守的DDxxD基序、RR基序及内部插入元件等关键结构特征。
研究对象（19）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 薄荷属植物 (Mentha) | 单萜生物合成 | limonene synthase | 柠檬烯合成酶 (limonene synthase) | 催化 | 催化GDP生成(-)-柠檬烯，也可产生α-、β-蒎烯和月桂烯；重组酶产物比例与天然酶一致 |
| grand fir (Abies grandis) | 单萜生物合成 | (-)-pinene synthase | (-)-蒎烯合成酶 | 催化 | 催化GDP生成(-)-α-pinene和(-)-β-pinene，比例为2:3 |
| grand fir (Abies grandis) | 单萜生物合成 | myrcene synthase (ag2) | 月桂烯合成酶 | 催化 | 催化GDP生成月桂烯，属于Tpsd亚家族 |
| Clarkia breweri | 单萜生物合成 | linalool synthase | 芳樟醇合成酶 | 催化 | 催化GDP生成芳樟醇；属于Tpsf分支，具有保守的内部插入序列 |
| 番茄 (Lycopersicon esculentum) | 倍半萜生物合成 | germacrene C synthase | 大牻牛儿烯C合成酶 | 催化 | 催化FDP生成germacrene C；属于Tpsa亚家族 |
| 棉花 (Gossypium hirsutum) | 倍半萜生物合成 | δ-cadinene synthase | δ-杜松烯合成酶 | 催化 | 催化FDP生成δ-cadinene，参与植保素生物合成，受诱导表达 |
| 烟草 (Nicotiana tabacum) | 倍半萜生物合成 | epi-aristolochene synthase | 表-马兜铃烯合成酶 | 催化 | 催化FDP生成epi-aristolochene；其晶体结构已解析，为α-螺旋桶状活性位点 |
| Hyoscyamus muticus | 倍半萜生物合成 | vetispiradiene synthase | 维蒂斯吡二烯合成酶 | 催化 | 催化FDP生成vetispiradiene；与epi-aristolochene synthase外显子互换可产生嵌合功能酶 |
| grand fir (Abies grandis) | 倍半萜生物合成 | δ-selinene synthase (ag4) | δ-蛇床烯合成酶 | 催化 | 催化FDP产生34种不同的倍半萜产物，属于多产物酶 |
| grand fir (Abies grandis) | 倍半萜生物合成 | γ-humulene synthase | γ-蛇麻烯合成酶 | 催化 | 催化FDP产生52种不同的倍半萜产物，属于多产物酶 |
| grand fir (Abies grandis) | 倍半萜生物合成 | (E)-α-bisabolene synthase (ag1) | (E)-α-红没药烯合成酶 | 催化 | 催化FDP生成(E)-α-bisabolene；含有保守插入序列和DDxxD基序 |
| 薄荷 (Mentha piperita) | 倍半萜生物合成 | (E)-β-farnesene synthase | (E)-β-金合欢烯合成酶 | 催化 | 从薄荷油腺cDNA文库随机克隆，催化FDP生成β-farnesene |
| 蓖麻 (Ricinus communis) | 二萜生物合成 | casbene synthase | 卡斯宾合成酶 | 催化 | 催化GGDP生成casbene；属于Tpsa亚家族，与倍半萜合酶机制相似 |
| 太平洋红豆杉 (Taxus brevifolia) | 二萜生物合成 | taxadiene synthase | 紫杉二烯合成酶 | 催化 | 催化GGDP生成taxadiene，系紫杉醇生物合成关键酶 |
| grand fir (Abies grandis) | 二萜生物合成 | abietadiene synthase (ag22) | 枞二烯合成酶 | 催化 | 双功能酶，催化GGDP先环化生成CDP，再进一步生成(-)-abietadiene；同时含有DxDD和DDxxD基序 |
| 拟南芥 (Arabidopsis thaliana) | 二萜生物合成（赤霉素合成） | (-)-CDP synthase (kaurene synthase A) | (-)-柯巴焦磷酸合酶 | 催化 | 通过质子化启动环化，催化GGDP生成(-)-CDP；不含DDxxD但含DxDD基序，单拷贝基因 |
| 拟南芥 (Arabidopsis thaliana) | 二萜生物合成（赤霉素合成） | kaurene synthase B | 贝壳杉烯合酶B | 催化 | 催化(-)-CDP电离环化生成(-)-kaurene；属于Tpse亚家族 |
| 玉米 (Zea mays) | 二萜生物合成（赤霉素合成） | (-)-CDP synthase (An1 locus) | (-)-柯巴焦磷酸合酶 | 催化 | 由赤霉素响应矮化突变体An1克隆，单拷贝基因 |
| 豌豆 (Pisum sativum) | 二萜生物合成（赤霉素合成） | (-)-CDP synthase | (-)-柯巴焦磷酸合酶 | 催化 | 通过拟南芥和玉米CDP合酶保守序列设计简并引物克隆 |
关键发现
- 单萜约1000种、倍半萜超过7000种、二萜超过3000种
- 植物萜类合成酶cDNA编码550~850个氨基酸
- 单萜合酶通常比倍半萜合酶大50~70个氨基酸
- 大多数二萜合酶比单萜合酶长约210个氨基酸
- limonene synthase的DDxxD基序中任一天冬氨酸突变为丙氨酸或谷氨酸使催化活性降低1000倍
- grand fir的δ-selinene synthase产生34种倍半萜产物，γ-humulene synthase产生52种产物
- (-)-pinene synthase以2:3比例产生α-pinene和β-pinene
- 重组limonene synthase产生(-)-limonene、α-、β-pinene和myrcene的比率与天然酶完全一致
- 单萜合酶mRNA在机械损伤后2小时内开始积累，2~4天达到峰值。
研究结论
植物萜类合成酶具有共同的进化起源和相似的三维结构，尽管一级序列差异较大。系统发育分析表明裸子植物与被子植物在分化后独立进化出功能多样化的萜类合成酶。保守的DDxxD基序和芳香族残基对催化至关重要。结构生物学和比较序列分析为合理设计萜类合成酶、改良代谢途径及生物技术生产萜类化合物奠定了基础。