A family of transketolases that directs isoprenoid biosynthesis via a mevalonate-independent pathway
- 作者
- B. Markus Lange, Mark R. Wildung, David McCaskill, Rodney Croteau
- 单位
- Institute of Biological Chemistry, Washington State University, Pullman, WA 99164-6340
- 杂志
- Proceedings of the National Academy of Sciences（1998）
- DOI
- 10.1073/pnas.95.5.2100
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
克隆并鉴定催化非甲羟戊酸途径第一步反应的1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶（DXPS）基因，以阐明植物质体中异戊二烯生物合成的新途径。
研究策略
从高度特化的薄荷油腺分泌细胞构建cDNA文库，随机测序获得类转酮醇酶克隆，再以此筛选全长cDNA，在大肠杆菌中异源表达并通过酶活测定和产物GC-MS鉴定确认功能。
核心内容
该研究从薄荷油腺分泌细胞构建的cDNA文库中克隆了编码1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶（DXPS）的基因，该酶催化非甲羟戊酸途径的第一步反应。通过随机测序获得类转酮醇酶克隆后筛选出全长cDNA，并在大肠杆菌中异源表达。酶活测定显示，重组DXPS的活性比大肠杆菌内源活性高7倍，其产物经GC-MS鉴定与1-脱氧-D-木酮糖标准品一致，证实了酶的功能。序列分析表明该酶与拟南芥CLA1、荚膜红细菌和大肠杆菌的DXPS具有较高同源性，构成一个由转酮醇酶演化而来的新蛋白家族。DXPS mRNA在薄荷叶片发育早期达到峰值，与单萜积累的时间动态吻合。这一发现直接证明了植物质体中存在独立于甲羟戊酸途径的异戊二烯生物合成路线，由于该途径仅存在于细菌和植物而动物中缺失，其关键酶可作为开发新型抗生素和除草剂的潜在靶点，也为植物萜类代谢工程改造提供了新思路。
创新点
首次从植物中克隆了DXPS基因，揭示了由转酮醇酶构成的新家族，该途径在细菌和植物中存在而动物中没有，为抗生素和除草剂设计提供新靶点。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli (异源表达宿主) | 非甲羟戊酸途径（丙酮酸/甘油醛-3-磷酸途径） | DXPS (1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase) | 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶 | 催化 | 来自薄荷（Mentha × piperita）的DXPS cDNA，异源表达后催化丙酮酸和GAP缩合生成1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸 |
| Mentha × piperita (薄荷) 油腺分泌细胞 | 单萜生物合成 (通过非甲羟戊酸途径提供IPP) | DXPS | 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶 | 催化 | 基因表达在叶片发育2.5-6天最高，与单萜合成速率峰值（第7天）相关 |
| 拟南芥 (Arabidopsis thaliana) | 非甲羟戊酸途径 | CLA1 | 转酮醇酶类蛋白（推测为DXPS） | 催化 | 序列比对显示与薄荷DXPS高度相似（85%相似性/77%一致性），突变导致白化表型 |
关键发现
- 薄荷DXPS cDNA（pDS29）包含2172 bp的ORF，去掉推测的质体转运肽后成熟蛋白约650个氨基酸、约71 kDa
- 异源表达后DXPS活性比大肠杆菌内源高7倍（n=7, P<0.01）
- 酶产物经脱磷酸和硅烷化后与1-脱氧-D-木酮糖标准品的GC-MS保留时间（6.71 min）和质谱一致
- DXPS mRNA在叶片发育2.5-6天时最高，单萜生物合成速率约在第7天达到峰值
- 序列相似性：与拟南芥CLA1为85/77%相似性/一致性，与Rhodobacter capsulatus ORF2814为72/56%，与大肠杆菌DXPS为69/48%，与Synechocystis为65/45%。
研究结论
薄荷DXPS基因的克隆直接证明植物质体中存在非甲羟戊酸途径，该途径与经典的细胞质甲羟戊酸途径平行，为植物异戊二烯生物合成的转基因改造提供了新策略，并因该途径仅存在于细菌和植物，可作为特异抗生素和除草剂的靶点。