Biosynthesis of terpenoids: 4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol synthase of Arabidopsis thaliana
- 作者
- Felix Rodhich, Juraithip Wungsintaweekul, Wolfgang Eisenreich, Gerald Richter, Christoph A. Schuhr, Stefan Hecht, Meinhart H. Zenk, Adelbert Bacher
- 单位
- Lehrstuhl für Organische Chemie und Biochemie, Technische Universität München; Biozentrum-Pharmazie, Universität Halle
- 杂志
- Proceedings of the National Academy of Sciences（2000）
- DOI
- 10.1073/pnas.97.12.6451
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
克隆并鉴定拟南芥中编码4-二磷酸胞苷-2C-甲基-D-赤藓醇合酶（IspD）的基因，研究其在非甲羟戊酸途径中的催化功能与酶学性质。
研究策略
基于大肠杆菌ispD基因序列进行同源搜索，从拟南芥cDNA中克隆该基因；将推测的催化结构域（氨基酸76-302）在大肠杆菌中异源表达并纯化；利用NMR确认酶促产物结构，并通过动力学实验测定酶学参数。
核心内容
该研究从拟南芥中克隆并鉴定了编码4-二磷酸胞苷-2C-甲基-D-赤藓醇合酶（IspD）的基因，该酶是植物非甲羟戊酸（MEP）途径中的关键酶。研究者基于大肠杆菌ispD基因序列进行同源搜索，从拟南芥cDNA中获得目的基因，发现其开放阅读框长909 bp，编码302个氨基酸，染色体基因全长2071 bp，含11个内含子和12个外显子。通过去除N端质体转运肽，研究者在大肠杆菌中异源表达了包含氨基酸76至302的催化结构域并纯化获得可溶性活性蛋白。NMR分析确认酶促产物为4-二磷酸胞苷-2C-甲基-D-赤藓醇，动力学实验测得该酶比活力为67 μmol·min⁻¹·mg⁻¹，对CTP和2C-甲基-D-赤藓醇4-磷酸的KM值分别为114 μM和500 μM。底物特异性分析显示该酶对CTP活性最高（100%），对dCTP和ATP的相对活性仅为8.9%和3.9%；二价金属离子中Mg²⁺活性最佳，Ni²⁺和Mn²⁺分别为91.4%和91.0%。该研究首次报道了植物来源的IspD合酶，证实其定位于质体并催化MEP途径的关键缩合反应，为深入理解植物萜类前体合成调控提供了酶学基础。
创新点
首次报道植物来源的4-二磷酸胞苷-2C-甲基-D-赤藓醇合酶；揭示了拟南芥ispD基因含有11个内含子且计算机预测外显子存在错误；通过去除N端质体转运肽获得可溶性催化结构域，并实现了高活性表达。
研究对象（2）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 拟南芥 (Arabidopsis thaliana) | 非甲羟戊酸途径（MEP途径） | ispD | 4-二磷酸胞苷-2C-甲基-D-赤藓醇合酶（全长前体） | 催化 | 植物内源基因，含有推测的N端质体转运肽 |
| 大肠杆菌 (Escherichia coli) | 非甲羟戊酸途径（MEP途径） | ispD（拟南芥同源基因的催化结构域） | 重组4-二磷酸胞苷-2C-甲基-D-赤藓醇合酶（氨基酸76-302） | 催化 | 异源表达并纯化，用于酶学性质表征 |
关键发现
- 拟南芥ispD基因的ORF为909 bp，编码302个氨基酸
- 染色体基因全长2071 bp，包含11个内含子（78-202 bp）和12个外显子
- 表达氨基酸残基76-302的催化结构域，纯化后比活力为67 μmol·min⁻¹·mg⁻¹
- 对CTP和2C-甲基-D-赤藓醇4-磷酸的KM值分别为114 μM和500 μM
- 酶促产物经NMR确认为4-二磷酸胞苷-2C-甲基-D-赤藓醇
- 酶对CTP底物特异性最高，相对活性为100%，dCTP为8.9%，ATP为3.9%
- 二价金属离子中Mg²⁺活性最高（100%），Ni²⁺为91.4%，Mn²⁺为91.0%。
研究结论
拟南芥ispD基因编码4-二磷酸胞苷-2C-甲基-D-赤藓醇合酶，定位于质体，催化2C-甲基-D-赤藓醇4-磷酸与CTP缩合生成4-二磷酸胞苷-2C-甲基-D-赤藓醇，是非甲羟戊酸途径中的关键酶。