Abietadiene Synthase from Grand Fir (Abies grandis) cDNA ISOLATION, CHARACTERIZATION, AND BACTERIAL EXPRESSION OF A BIFUNCTIONAL DITERPENE CYCLASE INVOLVED IN RESIN ACID BIOSYNTHESIS
- 作者
- Brigitte Stofer Vogel, Mark R. Wildung, Guido Vogel, Rodney Croteau
- 单位
- Institute of Biological Chemistry, and Department of Biochemistry and Biophysics, Washington State University, Pullman, Washington 99164-6340
- 杂志
- Journal of Biological Chemistry（1996）
- DOI
- 10.1074/jbc.271.38.23262
- 所属领域
- 天然产物生物合成
- 关键词
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解决的核心问题
验证大冷杉（Abies grandis）中枞酸生物合成的关键环化酶——枞二烯合酶（abietadiene synthase）是否为单一双功能酶，并克隆其cDNA进行功能和序列表征。
研究策略
从受伤大冷杉茎中纯化枞二烯合酶，经胰蛋白酶消化获得肽段序列，设计简并引物PCR扩增cDNA片段，筛选cDNA文库，获得全长cDNA并在大肠杆菌中异源表达，通过产物分析和序列比较验证酶的功能与结构特征。
核心内容
该研究从受伤的大冷杉茎中纯化出催化枞酸生物合成的关键酶枞二烯合酶，通过胰蛋白酶消化获得肽段序列，据此设计简并引物扩增cDNA片段并筛选文库，最终获得全长cDNA pAC22.1并成功在大肠杆菌中异源表达。该cDNA长2861 bp，开放阅读框编码868个氨基酸，预测蛋白分子量约99.5 kDa，推测成熟蛋白为87.9 kDa，与天然酶84 kDa相符。重组酶催化产物中abieta-7(8),13(14)-diene约占98%，sandaracopimaradiene约2%；天然酶产物中abietadiene≥97%，两者一致。序列比较显示其与紫杉二烯合酶相似性最高（67%相似、45%同一性），且同时含有DDXXD和DXXD两个天冬氨酸富集基序。该结果证实单一双功能酶即可催化香叶基香叶基二磷酸经(+)-copalyl二磷酸和pimaradiene中间体生成枞二烯，其氨基端与质子化启动环化酶同源、羧基端与电离化启动环化酶同源，代表了一类新型双功能萜类环化酶机制，为后续异源生产和机制解析奠定了基础。
创新点
['首次克隆并功能表达大冷杉枞二烯合酶cDNA', '证明单一蛋白催化质子化启动和电离化启动的两类环化反应', '发现该酶融合了两种类型萜类环化酶的结构域，提出双功能环化酶机制']
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Abies grandis (大冷杉) | 树脂酸（松香酸）生物合成 | abietadiene synthase (cDNA clone pAC22.1) | Abietadiene synthase（枞二烯合酶，天然酶） | 催化 | 从受伤茎中纯化，分子量84 kDa，催化geranylgeranyl diphosphate环化生成abietadiene |
| Escherichia coli | 二萜（枞酸）异源生物合成 | 重组abietadiene synthase cDNA (pAC22.1) | 重组Abietadiene synthase | 催化 | 大肠杆菌异源表达，产物含约98% abietadiene，活性约1.0-3.5 nmol/培养物 |
| Abies grandis (大冷杉) | 树脂酸（松香酸）生物合成 | abietadiene synthase N端转运肽编码序列 | 质体转运肽（plastidial transit peptide） | 区室化 | 预测将酶定位到质体（leucoplast），切割位点Ala110与Ser111之间 |
关键发现
- 克隆的cDNA pAC22.1长度为2861 bp，开放阅读框2604 bp，编码868个氨基酸，预测分子量99,535；推测成熟蛋白为87.9 kDa，pI
- 1，与天然酶84 kDa和pI
- 9相符。重组酶在大肠杆菌中异源表达，产物中abieta-7(8),13(14)-diene约占98%，sandaracopimaradiene约2%；纯化天然酶产物中abietadiene≥97%，sandaracopimaradiene<3%；重组表达活性为1.0-3.5 nmol/培养物。序列比较显示，枞二烯合酶与紫杉二烯合酶相似性最高（67%相似，45%同一性），与其它植物萜类环化酶相似性在51%-57%之间，并包含DDXXD和DXXD两个保守天冬氨酸富集基序。
研究结论
研究证实单一双功能酶abietadiene synthase催化geranylgeranyl diphosphate经(+)-copalyl diphosphate和pimaradiene中间体生成abieta-7(8),13(14)-diene；该酶氨基端与质子化启动环化酶同源，羧基端与电离化启动环化酶同源，属于新型双功能萜类环化酶。cDNA的获得为深入机制研究和异源表达奠定了基础。