Sesquiterpene Synthases from Grand Fir (Abies grandis): COMPARISON OF CONSTITUTIVE AND WOUND-INDUCED ACTIVITIES, AND cDNA ISOLATION, CHARACTERIZATION, AND BACTERIAL EXPRESSION OF δ-SELINENE SYNTHASE AND γ-HUMULENE SYNTHASE
- 作者
- Christopher L. Steele, John Crock, Jörg Bohlmann, Rodney Croteau
- 单位
- Institute of Biological Chemistry, Program in Plant Physiology, and Department of Biochemistry and Biophysics, Washington State University, Pullman, Washington 99164-6340
- 杂志
- Journal of Biological Chemistry（1998）
- DOI
- 10.1074/jbc.273.4.2078
- 所属领域
- 植物代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
解析巨冷杉（Abies grandis）树脂中倍半萜烯的组成及其组成型和创伤诱导的合成机制，并克隆表征负责合成这些倍半萜烯的关键酶。
研究策略
采用相似性克隆策略，利用保守氨基酸序列设计简并引物，通过PCR从创伤诱导的茎cDNA文库中筛选cDNA；将候选cDNA在大肠杆菌中异源表达，用放射性标记底物和GLC-MS分析酶产物；同时比较组成型和创伤诱导的细胞提取物酶活性。
核心内容
该研究以巨冷杉为对象，旨在解析树脂中倍半萜烯的组成及创伤诱导合成机制，并克隆关键酶基因。研究者采用相似性克隆策略，利用保守氨基酸序列设计简并引物，从创伤诱导茎cDNA文库中筛选出两个倍半萜烯合酶cDNA，即δ-selinene合酶（ag4）和γ-humulene合酶（ag5），并在大肠杆菌中异源表达，结合放射性标记底物与GLC-MS进行产物分析。结果显示，巨冷杉松节油至少含38种倍半萜烯，占总松节油12.5%，主要成分包括α-cubebene、α-copaene和β-caryophyllene等。创伤诱导后细胞提取物额外产生δ-cadinene和(E)-α-bisabolene，诱导型酶Km约0.4 μM。表达的δ-selinene合酶可催化生成至少34种倍半萜烯，主产物δ-selinene占25.3%；γ-humulene合酶生成至少52种，主产物γ-humulene占28.6%。两种酶对FPP的Km分别为1.5 μM和4.5 μM，且δ-selinene合酶显著偏好Mg2+。序列分析显示两者83%相似、65%一致，与裸子植物其他萜类合酶相似性约66%。该发现首次从裸子植物克隆出多产物倍半萜烯合酶，揭示了其极度复杂的催化机制，为萜类合酶结构功能研究和树木抗虫遗传改良提供了靶点。
创新点
1. 首次从裸子植物中克隆并功能表达两个多产物倍半萜烯合酶；2. 发现这两个酶分别产生34和52种倍半萜烯，是迄今描述的最复杂的萜类环化酶；3. 明确了创伤诱导仅导致δ-cadinene和(E)-α-bisabolene两种新产物的合成；4. 揭示了γ-humulene合酶催化极其复杂的反应级联，包括Wagner-Meerwein重排。
研究对象（2）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21(DE3) | 倍半萜烯生物合成 | ag4 (δ-selinene synthase) | δ-selinene synthase | 催化 | 催化FPP环化生成至少34种倍半萜烯，主要产物δ-selinene（25.3%）；也能利用GPP生成单萜（主要为limonene）。 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 倍半萜烯生物合成 | ag5 (γ-humulene synthase) | γ-humulene synthase | 催化 | 催化FPP环化生成至少52种倍半萜烯，主要产物γ-humulene（28.6%）；也能利用GPP生成单萜（主要为limonene），且反应涉及Wagner-Meerwein重排。 |
关键发现
- 巨冷杉松节油中至少含38种倍半萜烯，占总松节油的12.5%
- 六种主要成分（α-cubebene、α-copaene、β-caryophyllene、α-muurolene、δ-cadinene、(E,E)-germacrene B）占62%。创伤诱导后，细胞提取物额外产生δ-cadinene和(E)-α-bisabolene，诱导型酶的Km约为0.4 μM。克隆的δ-selinene合酶（ag4）催化产生至少34种倍半萜烯，主要产物δ-selinene（25.3%）、(E,E)-germacrene B（17.4%）和guaia-6,9-diene（9.7%）
- γ-humulene合酶（ag5）产生至少52种倍半萜烯，主要产物γ-humulene（28.6%）、sibirene（15.1%）和longifolene（11.8%）。δ-selinene合酶cDNA编码581个氨基酸（67.6 kDa），γ-humulene合酶cDNA编码593个氨基酸（67.9 kDa），两者序列83%相似、65%一致。对FPP的Km：γ-humulene合酶约4.5 μM，δ-selinene合酶约1.5 μM
- Mg2+和Mn2+的Km分别约125 μM和25 μM。δ-selinene合酶显著偏好Mg2+（Mn2+时最大活性低于Mg2+的10%），γ-humulene合酶对两者活性相当。两种酶也能以GPP为底物生成单萜，速率约为FPP的一半，主要产物为limonene。与裸子植物其他萜类合酶序列相似性约66%、一致性约45%
- 与被子植物合酶相似性约56%、一致性约30%
- 与真菌trichodiene合酶相似性45-46%、一致性18-22%。
研究结论
巨冷杉的δ-selinene合酶和γ-humulene合酶是组成型树脂中大量倍半萜烯的主要来源，它们催化生成数十种产物，反应机制极为复杂；创伤诱导的δ-cadinene和(E)-α-bisabolene由其他未克隆的酶催化。这两个cDNA为研究萜类合酶的结构-功能关系及基因调控提供了重要工具，也为遗传改造树木抗虫防御能力提供了靶点。