Functional Expression and Extension of Staphylococcus Staphylococcus Biosynthetic Pathway in Escherichia coli
- 作者
- Se Hyeuk Kim, Pyung Cheon Lee
- 单位
- Department of Molecular Science and Technology and Department of Biotechnology, Ajou University, Woncheon-dong, Yeongtong-gu, Suwon 443-749, South Korea
- 杂志
- Journal of Biological Chemistry（2012）
- DOI
- 10.1074/jbc.M112.343020
- 所属领域
- 代谢工程/合成生物学
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解决的核心问题
金黄葡萄球菌的类胡萝卜素staphyloxanthin生物合成途径此前被认为由五个酶组成，但仅表达五个酶在大肠杆菌中无法合成终产物，导致醛中间体积累，需要鉴定缺失的酶并实现完整途径的异源表达。
研究策略
采用合成生物学模块化重构策略：在大肠杆菌中通过人工合成操纵子分步表达已知途径基因，通过BLAST搜索候选醛脱氢酶基因，共表达验证功能，并通过S. aureus基因敲除验证，最后构建完整六酶途径。
核心内容
该研究通过合成生物学模块化重构策略，解析并完善了金黄色葡萄球菌类胡萝卜素staphyloxanthin的生物合成途径。研究者在大肠杆菌中分步表达已知的五个途径基因，发现仅能积累4,4'-diaponeurosporen-4-al和4,4'-diapolycopene-dial等醛中间体而无法生成终产物，随后通过BLAST搜索候选醛脱氢酶基因并共表达验证，成功鉴定出第六个关键酶AldH（4,4'-diaponeurosporen-aldehyde dehydrogenase），其编码基因位于S. aureus基因组中距离已知基因簇670 kb处。敲除S. aureus的aldH导致staphyloxanthin合成丧失并积累醛中间体，证实该酶不可或缺。最终在大肠杆菌中表达完整六酶途径，成功产生staphyloxanthin样化合物十四酰-葡萄糖基-4,4'-diaponeurosporenoic acid（m/z=803.50）和十六酰-葡萄糖基类似物（m/z=832.66），其脂肪酸分别为肉豆蔻酸和棕榈酸，并生成两种结构新颖的类胡萝卜素产物。该工作首次阐明staphyloxanthin途径由六酶组成，证明合成模块化重构在途径解析和产物多样化中的有效性，同时揭示酰基转移酶CrtO具有底物宽泛性。
创新点
首次鉴定出金黄色葡萄球菌staphyloxanthin生物合成途径的第六个酶——4,4'-diaponeurosporen-aldehyde dehydrogenase (AldH)；首次在大肠杆菌中功能性表达完整的staphyloxanthin生物合成途径；利用合成模块方法产生了结构新颖的类胡萝卜素化合物；揭示了酰基转移酶CrtO的底物宽泛性。
研究对象（11）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli SURE (异源表达宿主) | Staphyloxanthin生物合成途径 (C30类胡萝卜素) | crtM | CrtM (4,4'-diapophytoene synthase) | 催化 | 催化两分子法尼基焦磷酸缩合生成4,4'-diapophytoene |
| Escherichia coli SURE (异源表达宿主) | Staphyloxanthin生物合成途径 (C30类胡萝卜素) | crtN | CrtN (4,4'-diapophytoene desaturase) | 催化 | 催化4,4'-diapophytoene脱氢生成4,4'-diaponeurosporene |
| Escherichia coli SURE (异源表达宿主) | Staphyloxanthin生物合成途径 (C30类胡萝卜素) | crtP | CrtP (4,4'-diaponeurosporene oxidase) | 催化 | 催化4,4'-diaponeurosporene末端氧化引入醛基 |
| Escherichia coli SURE (异源表达宿主) | Staphyloxanthin生物合成途径 (C30类胡萝卜素) | crtQ | CrtQ (glycosyltransferase) | 催化 | 催化4,4'-diaponeurosporenoic acid的糖基化 |
| Escherichia coli SURE (异源表达宿主) | Staphyloxanthin生物合成途径 (C30类胡萝卜素) | crtO | CrtO (acyltransferase) | 催化 | 催化糖基化中间体的酰基化，对脂肪酸底物具有广谱性 |
| Escherichia coli SURE (异源表达宿主) | Staphyloxanthin生物合成途径 (C30类胡萝卜素) | aldH (S. aureus) | AldH (4,4'-diaponeurosporen-aldehyde dehydrogenase) | 催化 | 第六个途径酶，催化4,4'-diaponeurosporen-4-al氧化为4,4'-diaponeurosporenoic acid |
| Escherichia coli SURE (异源表达宿主) | Staphyloxanthin生物合成途径 (C30类胡萝卜素) | gbsA (S. aureus) | GbsA (glycine betaine aldehyde dehydrogenase) | 催化 | 候选醛脱氢酶，实验中未显示催化类胡萝卜素醛的活性 |
| Escherichia coli SURE (异源表达宿主) | Staphyloxanthin生物合成途径 (C30类胡萝卜素) | aldA (S. aureus) | AldA (aldehyde dehydrogenase homolog) | 催化 | 候选醛脱氢酶，实验中未显示催化类胡萝卜素醛的活性 |
| Escherichia coli SURE (异源表达宿主) | Staphyloxanthin生物合成途径 (C30类胡萝卜素) | NWMN_2026 (S. aureus) | Aldehyde dehydrogenase family protein | 催化 | 候选醛脱氢酶，实验中未显示催化类胡萝卜素醛的活性 |
| Escherichia coli SURE (异源表达宿主) | Staphyloxanthin生物合成途径 (C30类胡萝卜素) | aldH (S. carnosus) | AldH (4,4'-diaponeurosporen-aldehyde dehydrogenase) | 催化 | 来自非产色素的S. carnosus，与S. aureus AldH有78%氨基酸一致性，能催化同一氧化反应 |
| Staphylococcus aureus RN4220 (野生型及aldH敲除株) | Staphyloxanthin生物合成途径 (C30类胡萝卜素) | aldH | AldH | 催化 | 敲除实验验证了AldH在天然宿主中催化醛氧化为羧酸的关键作用 |
关键发现
- 鉴定出staphyloxanthin途径第六种酶AldH，其编码基因位于S. aureus基因组中距离已知途径基因簇670 kb处
- 五个已知酶在大肠杆菌中仅积累4,4'-diaponeurosporen-4-al和4,4'-diapolycopene-dial
- 共表达aldH后生成4,4'-diaponeurosporenoic acid（LC/MS [M-H]- m/z=431.24）和4,4'-diapolycopene-4,4'-dioic acid（m/z=459.18）
- S. carnosus的AldH与S. aureus AldH具有78%氨基酸同源性，也能催化该氧化反应
- 敲除S. aureus RN4220的aldH导致staphyloxanthin合成丧失，并积累醛中间体
- 在大肠杆菌中表达完整六酶途径产生staphyloxanthin样化合物：十四酰-葡萄糖基-4,4'-diaponeurosporenoic acid（[M-H]- m/z=803.50）和十六酰-葡萄糖基-4,4'-diaponeurosporenoic acid（m/z=832.66），其脂肪酸分别为肉豆蔻酸(C14:0)和棕榈酸(C16:0)，而非天然staphyloxanthin的12-甲基十四酸（该支链脂肪酸在37°C时占S. aureus总脂肪酸的47%）
- 同时产生新型化合物4,4'-diapolycopene-4'-al-4-oic acid（m/z=443.08）和4,4'-diapolycopeneic acid（m/z=429.01）。
研究结论
金黄色葡萄球菌的staphyloxanthin生物合成途径实际上由六个酶（CrtM、CrtN、CrtP、CrtQ、CrtO和AldH）组成，AldH催化醛中间体氧化为羧酸，是合成staphyloxanthin所必需。通过合成模块重构，首次在大肠杆菌中实现了该六酶途径的功能表达，产生staphyloxanthin样化合物和新型类胡萝卜素，证明了合成生物学模块化方法在途径解析和结构多样化中的强大能力。