Construction and Characterization of Genetically Modified Synechocystis sp. PCC 6803 Photosystem II Core Complexes Containing Carotenoids with Shorter π-Conjugation than β-Carotene
- 作者
- James A. Bautista, Cara A. Tracewell, Eberhard Schlodder, Francis X. Cunningham, Jr., Gary W. Brudvig, Bruce A. Diner
- 单位
- E. I. du Pont de Nemours & Co., Experimental Station, Wilmington, Delaware 19880-0173, USA; Department of Chemistry, Yale University, New Haven, Connecticut 06520-8107, USA; Technische Universität Berlin, Strasse des 17. Juni 135, 10623 Berlin, Germany; Department of Cell Biology and Molecular Genetics, University of Maryland, College Park, Maryland 20742, USA
- 杂志
- Journal of Biological Chemistry（2005）
- DOI
- 10.1074/jbc.M504953200
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
阐明光合系统II中类胡萝卜素在次级电子传递途径中的氧化还原功能，通过遗传改造缩短类胡萝卜素的共轭π电子系统以测试其作用。
研究策略
用Rhodobacter capsulatus的八氢番茄红素脱饱和酶基因(crtI)替换Synechocystis sp. PCC 6803的ζ-胡萝卜素脱饱和酶基因(zds)或同时替换zds和八氢番茄红素脱饱和酶基因(pds)，产生具有更短共轭π电子系统的类胡萝卜素（如neurosporene和β-zeacarotene），纯化PSII核心复合物，利用低温可见和近红外光谱研究光诱导的叶绿素和类胡萝卜素阳离子自由基的形成与衰减。
核心内容
该研究通过遗传改造集胞藻PCC 6803，以Rhodobacter capsulatus的八氢番茄红素脱饱和酶基因crtI替换内源zds或同时替换zds和pds，成功构建了Pdscap1和Pdscap2突变株，使PSII核心复合物中β-胡萝卜素完全缺失，代之以仅含9个共轭双键的β-zeacarotene和neurosporene等短共轭类胡萝卜素，且PSII核心仍能正常组装。低温光谱显示，Pdscap2中类胡萝卜素阳离子吸收峰位于898 nm，较野生型984 nm蓝移86 nm，突变体Chl+/Car+比例较野生型高约2倍，ChlZ氧化水平高约1.25倍；突变体PSII产量仅为野生型的10–20%，但光还原QA的中心仍保留约80%。据此估算9个共轭双键类胡萝卜素阳离子的还原电位为1.12–1.15 V，高于β-胡萝卜素，支持P680+具有更高氧化还原电位的结论。类胡萝卜素阳离子衰减动力学不支持经P680+QA−复合物重组，而更符合直接与QA−重组。该工作首次在蓝藻中实现PSII类胡萝卜素组成替换，证实β-紫罗酮环对PSII组装不可或缺，并揭示了短共轭类胡萝卜素提升还原电位后改变电子传递分支比例的新机制，为光合作用次级电子传递途径的功能研究提供了关键实验证据。
创新点
['首次在蓝藻中通过基因替换实现PSII中β-胡萝卜素被短共轭类胡萝卜素（β-zeacarotene等）替代，且PSII核心复合物仍能组装。', '证明β-紫罗酮环的存在是PSII组装所必需的。', '利用不同共轭长度的类胡萝卜素研究次级电子传递途径，为P680+具有更高氧化还原电位提供了实验支持。']
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Synechocystis sp. PCC 6803 | 类胡萝卜素生物合成 | zds | ζ-胡萝卜素脱饱和酶 | 催化 | 编码ζ-胡萝卜素脱饱和酶，催化ζ-胡萝卜素转化为番茄红素；在Pdscap1和Pdscap2中被crtI替代。 |
| Synechocystis sp. PCC 6803 | 类胡萝卜素生物合成 | pds | 八氢番茄红素脱饱和酶 | 催化 | 编码八氢番茄红素脱饱和酶，催化八氢番茄红素转化为ζ-胡萝卜素；在Pdscap2中被crtI替代。 |
| Synechocystis sp. PCC 6803 | 类胡萝卜素生物合成 | crtI (Rhodobacter capsulatus) | 八氢番茄红素脱饱和酶(CrtI) | 催化 | 来自R. capsulatus的脱饱和酶，可将八氢番茄红素转化为neurosporene，进而环化为β-zeacarotene；在Pdscap1和Pdscap2中异源表达。 |
| Synechocystis sp. PCC 6803 | 光合作用电子传递 | — | Photosystem II核心复合物（含D1/D2、CP43、CP47、Cyt b559等） | 能量供给 | 研究类胡萝卜素在PSII次级电子传递途径中的氧化还原功能，特别是β-zeacarotene替代β-胡萝卜素后的影响。 |
关键发现
- 构建了Pdscap1（zds被crtI替换）和Pdscap2（zds和pds均被crtI替换）突变株，其PSII核心复合物中β-胡萝卜素完全缺失，主要类胡萝卜素为β-zeacarotene（9个共轭双键）和neurosporene（9个共轭双键）。WT、Pdscap1和Pdscap2的Chl a数分别为37.9±2.1、38.4±1.6和38.6±1.4（每2个Pheo a），类胡萝卜素总量分别为12.6±1.4、10.5±0.8和13.2±1.3。Pdscap2中β-zeacarotene为8.3±0.4，cis-β-zeacarotene为0.7±0.2，OH-β-zeacarotene为1.9±0.1，neurosporene为1.9±0.4。在20K，Pdscap2的类胡萝卜素阳离子吸收峰位于898 nm，比WT（984 nm）蓝移86 nm
- 突变体Chl+/Car+比例比WT高约2倍，ChlZ氧化（666 nm）比WT高约1.25倍。Pdscap1和Pdscap2的PSII产量分别约为WT的10%和15-20%
- 突变体中可进行光还原QA的中心比WT低约20%。类胡萝卜素阳离子衰减在Pdscap2中比WT慢。估计9个共轭双键类胡萝卜素阳离子的还原电位为1.12-1.15 V vs NHE。随温度从20K升至160K，Pdscap2的Car+吸收峰从898 nm红移至907 nm和913 nm。
研究结论
遗传改造成功用β-zeacarotene等短共轭类胡萝卜素替代PSII中的β-胡萝卜素，证明β-紫罗酮环对PSII组装必要。P680+能氧化9个共轭双键的类胡萝卜素，支持更高的还原电位估算。短共轭类胡萝卜素更高的还原电位导致Chl+产量增加。类胡萝卜素阳离子衰减动力学不支持通过P680+Q-A复合物重组，而是直接与QA-重组。