Characterization of a phosphotriesterase from genetically-engineered Escherichia coli
- 作者
- Yen-Der Cheng, Jeffrey S. Karns, Alba Torrents
- 单位
- Environmental Engineering Program, Department of Civil Engineering, University of Maryland, College Park, MD 20742; Soil Microbial Systems Laboratory, Room 140 Building 001 BARC-West 10300 Baltimore Ave., Beltsville, MD 20705-2350
- 杂志
- Journal of Environmental Science and Health, Part B: Pesticides, Food Contaminants, and Agricultural Wastes（1998）
- DOI
- 10.1080/03601239809373150
- 所属领域
- 酶工程
- 关键词
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解决的核心问题
表征重组大肠杆菌中表达的磷酸三酯酶（PTE）的催化活性与稳定性，并评估其用于有机磷农药废物解毒处理的可行性。
研究策略
从携带 Flavobacterium opd 基因的大肠杆菌 DH-5α 中纯化 PTE，通过改变 pH、温度和金属离子条件测定酶活性与稳定性，采用平衡透析和 Scatchard 分析测定金属结合常数，并利用模拟连续搅拌反应器（CSTR）系统评估酶在典型废水流中的操作稳定性。
核心内容
该研究系统表征了重组大肠杆菌DH-5α中表达的磷酸三酯酶（PTE）的催化特性与操作稳定性。通过改变pH、温度和金属离子条件测定酶活，结合平衡透析与Scatchard分析金属结合常数，并在模拟连续搅拌反应器（CSTR）中评估了不同流入液对酶长期稳定性的影响。结果显示PTE最适条件为35°C、pH 8.5，pH 8下孵育24小时保留85%活性，而pH 6下仅存56%；35°C时Km和Vmax分别较25°C高50%和17%。Co²⁺可使初始活性提高24%，而Zn²⁺存在36小时时活性降至无金属对照的33%。酶可结合约2当量金属离子，对Co²⁺亲和常数（Ka=0.66）比Zn²⁺（Ka=0.49）高30%。在含5%乙醇或1mM EDTA的连续流中PTE 24小时内几乎完全失活，去离子水中保留约30%活性，而含1mM Co²⁺时活性稳定。该结果表明Co²⁺对维持PTE活性和稳定性至关重要，实际用于农药废水处理时需补充Co²⁺或通过修饰提高酶稳定性。
创新点
系统表征了 PTE 对 Co²⁺ 和 Zn²⁺ 的结合亲和力差异，发现 Co²⁺ 对维持酶活性和稳定性具有关键作用；首次在模拟连续流系统中考察了不同流入液（乙醇、EDTA、Co²⁺、去离子水）对 PTE 长期稳定性的影响。
研究对象（1）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli DH-5α | 有机磷农药降解 | opd | phosphotriesterase (PTE) | 催化 | 来自 Flavobacterium ATCC27551 的 opd 基因克隆于质粒 pJK33，在 E. coli DH-5α 中表达，用于水解有机磷酸酯类农药。 |
关键发现
- PTE 的最适催化条件为 35°C、pH 8.5
- 在 pH 8 下孵育 24 小时保留 85% 初始活性，pH 6 下保留 56%
- 35°C 时 Km 和 Vmax 分别比 25°C 时高 50% 和 17%
- Co²⁺ 可使 PTE 初始活性提高 24%，而 Zn²⁺ 存在 36 小时时活性降至无金属对照的 33%，48 小时降至初始活性的 25%
- PTE 可结合约 2 当量金属离子（Co²⁺ n=1.8，Zn²⁺ n=2.4），且对 Co²⁺ 的亲和常数（Ka=0.66）比 Zn²⁺（Ka=0.49）高 30%
- 在含 5% 乙醇或 1 mM EDTA 的连续流中，PTE 在 24 小时内几乎完全失活，在去离子水流中保留约 30% 初始活性，而在含 1 mM Co²⁺ 的流中 24 小时活性稳定。
研究结论
PTE 在 pH 8 和 35°C 下活性最高，Co²⁺ 对维持酶活性和稳定性至关重要；在无 Co²⁺ 的连续流系统中 PTE 快速失活，实际应用于农药废水处理时需要补充 Co²⁺ 或通过化学/物理修饰提高酶稳定性。