D-Allulose (D-Psicose) Biotransformation From Allitol by a Newly Found NAD(P)-Dependent Alcohol Dehydrogenase From Gluconobacter frateurii NBRC 3264 and the Enzyme Characterization
- 作者
- Xin Wen, Huibin Lin, Yuhang Ning, Guangwen Liu, Yilin Ren, Can Li, Chengjia Zhang, Jianqun Lin, Xin Song, Jianqiang Lin
- 单位
- State Key Laboratory of Microbial Technology, Shandong University; Shandong Academy of Chinese Medicine; Qingdao Longding Biotech Limited Company; School of Biological Engineering, Qilu University of Technology
- 杂志
- Frontiers in Microbiology（2022）
- DOI
- 10.3389/fmicb.2022.870168
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
传统D-阿洛酮糖生产主要依赖差向异构酶催化D-果糖转化，受热力学平衡限制，转化率仅约30%，且产物分离困难；本文旨在利用脱氢酶从allitol脱氢生成D-allulose，以突破热力学平衡限制并提高转化率。
研究策略
从Gluconobacter frateurii NBRC 3264中克隆NAD(P)依赖型醇脱氢酶(ADH)基因，在大肠杆菌BL21 star(DE3)中异源表达并纯化；研究其酶学性质（pH、温度、金属离子影响），通过添加Co2+激活酶活性，并建立动力学模型以模拟和优化反应过程。
核心内容
本研究从Gluconobacter frateurii NBRC 3264中克隆了一个NAD(P)依赖型醇脱氢酶基因，并在大肠杆菌BL21 star(DE3)中异源表达和纯化，用于催化allitol脱氢生成D-allulose。酶学表征显示重组酶分子量约36.5 kDa，最适温度50°C，最适pH 7.0。研究发现Co2+能显著激活该酶，使酶活性提高225%，而Zn2+和Ni2+分别提高54.1%和19.1%。在1 mM Co2+存在下，以50、150、250 mM allitol为底物反应4小时，D-allulose产率分别达到97%、56%和38%，较无Co2+时提高约1.6-1.7倍。动力学模型表明Co2+可将底物亲和常数Ks从321.809 mM降至21.782 mM，同时存在产物抑制（Ki=10.740 mM）。该酶突破传统差向异构酶法约30%转化率的热力学限制，最高转化率可达97%，展现了工业化生产D-阿洛酮糖的巨大潜力。
创新点
首次报道了可催化allitol转化为D-allulose的酶（NAD(P)依赖型醇脱氢酶）；发现Co2+能显著激活该酶，使D-allulose转化率最高达97%，远超差向异构酶法的约30%。
研究对象（2）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Gluconobacter frateurii NBRC 3264（基因来源菌株） | D-阿洛酮糖生物转化（allitol→D-allulose） | adh（locus_tag: GFR01_RS14945） | NAD(P)依赖型醇脱氢酶（WP_099183078.1） | 催化 | 首次发现的能催化allitol脱氢生成D-allulose的酶 |
| Escherichia coli BL21 star(DE3)（异源表达宿主） | D-阿洛酮糖生物转化（allitol→D-allulose） | adh（重组质粒pET22b-adh） | 重组ADH（含His标签） | 催化 | 用于酶表达、纯化及转化反应 |
关键发现
- 重组ADH可催化allitol生成D-allulose，分子量约36.5 kDa
- 最适温度50°C，最适pH 7.0
- Co2+使酶活性提高225%，Zn2+和Ni2+分别提高54.1%和19.1%
- 在1 mM Co2+及allitol浓度50、150、250 mM条件下反应4 h，D-allulose产率分别达到97%、56%、38%，较无Co2+时提高约1.6-1.7倍
- 热稳定性方面，50°C下保温1 h、2 h、3 h后残留活性分别为71.5%、42.4%、25.6%
- 动力学模型显示Co2+使底物亲和常数Ks从321.809 mM降至21.782 mM，并存在产物抑制（Ki=10.740 mM，α=1.326）。
研究结论
本研究发现并表征了一种能将allitol高效转化为D-allulose的新型NAD(P)依赖型醇脱氢酶，Co2+可显著提高其活性和转化率，最高达97%，该酶在D-阿洛酮糖工业化生产中具有巨大应用潜力。