Plant-derived isoprenoid sweeteners: recent progress in biosynthetic gene discovery and perspectives on microbial production
- 作者
- Hikaru Seki, Keita Tamura, Toshiya Muranaka
- 单位
- Department of Biotechnology, Graduate School of Engineering, Osaka University, Suita, Japan
- 杂志
- Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry（2017）
- DOI
- 10.1080/09168451.2017.1387514
- 所属领域
- 代谢工程/合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
解析植物来源异戊二烯类甜味剂（甜菊糖苷、罗汉果苷、甘草甜素）的生物合成基因及其催化功能，并探讨利用微生物生产这些天然甜味剂的可行性。
研究策略
结合高通量测序与功能基因组学，从非模式植物中发现并鉴定关键生物合成酶，并通过代谢工程和合成生物学手段，在酿酒酵母等微生物底盘重构生物合成途径。
核心内容
该综述系统总结了甜菊糖苷、罗汉果苷和甘草甜素三类植物源异戊二烯类甜味剂的生物合成基因挖掘进展，并评估了利用微生物底盘实现可持续生产的潜力。文章整合高通量测序与功能基因组学策略，从非模式植物中鉴定关键酶：在甜菊中明确了从异贝壳杉烯到多种糖基化甜菊醇衍生物的完整P450氧化与UGT糖基化级联；在罗汉果中揭示了环氧水解酶介导C-24/C-25羟基化的独特机制，并首次阐明甘草甜素末端由GuUGAT连续催化两步葡萄糖醛酸基转移反应。关键数据表明，甜菊苷甜度为蔗糖的150–250倍，莱鲍迪苷A达200–300倍，罗汉果苷V甜度超蔗糖300倍且占鲜果果肉约1%，甘草甜素在根中占干重2–8%。代谢工程方面，敲除PAH1基因以扩增酿酒酵母内质网，使三萜积累提高16倍、青蒿酸产量提升2倍；高甘草酸菌株中bAS、CYP88D6及CYP72A154转录水平较低产菌株高7–15倍。这些发现意味着三类甜味剂的关键生物合成酶已基本解析，通过微生物异源表达重构途径正成为现实，未来优化代谢通量、内质网形态及糖基转移酶效率将进一步提升产量与纯度。
创新点
综述了三种甜味剂生物合成基因的最新发现，特别是罗汉果苷V完整途径中环氧水解酶（EPH）介导的C-24/C-25羟基化机制，以及甘草甜素生物合成末端GuUGAT连续两步葡萄糖醛酸基转移反应的阐明；同时总结了通过PAH1敲除扩增内质网以增强三萜产量的代谢工程策略。
研究对象（22）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Stevia rebaudiana | 甜菊糖苷生物合成（二萜类） | ent-CPS | ent-copalyl diphosphate synthase | 催化 | 催化GGPP环化生成ent-copalyl diphosphate |
| Stevia rebaudiana | 甜菊糖苷生物合成（二萜类） | ent-KS | ent-kaurene synthase | 催化 | 催化ent-copalyl diphosphate生成ent-kaurene |
| Stevia rebaudiana | 甜菊糖苷生物合成（二萜类） | ent-KO | ent-kaurene oxidase (P450) | 催化 | 催化ent-kaurene氧化为ent-kaurenoic acid |
| Stevia rebaudiana | 甜菊糖苷生物合成（二萜类） | CYP716D4 | ent-kaurenoic acid 13-hydroxylase (P450) | 催化 | 推测催化C-13羟基化，但尚无功能验证 |
| Stevia rebaudiana | 甜菊糖苷生物合成（糖基化步骤） | UGT85C2 | UDP-dependent glycosyltransferase 85C2 | 催化 | 催化C-13羟基葡萄糖基化生成甜菊醇单糖苷 |
| Stevia rebaudiana | 甜菊糖苷生物合成（糖基化步骤） | UGT91D2 | UDP-dependent glycosyltransferase 91D2 | 催化 | 催化C-13葡萄糖的C-2'位加糖生成甜菊醇双糖苷 |
| Stevia rebaudiana | 甜菊糖苷生物合成（糖基化步骤） | UGT74G1 | UDP-dependent glycosyltransferase 74G1 | 催化 | 催化C-19羧基糖基化生成甜菊苷 |
| Stevia rebaudiana | 甜菊糖苷生物合成（糖基化步骤） | UGT76G1 | UDP-dependent glycosyltransferase 76G1 | 催化 | 催化C-13葡萄糖的C-3'位加糖生成莱鲍迪苷A |
| Siraitia grosvenorii | 罗汉果苷生物合成（三萜类） | SQE | squalene epoxidase | 催化 | 催化鲨烯环氧化生成2,3;22,23-双环氧鲨烯 |
| Siraitia grosvenorii | 罗汉果苷生物合成（三萜类） | CDS | cucurbitadienol synthase | 催化 | 催化2,3;22,23-双环氧鲨烯环化生成24,25-环氧葫芦二烯醇 |
| Siraitia grosvenorii | 罗汉果苷生物合成（三萜类） | EPH | epoxide hydrolase | 催化 | 催化24,25-环氧葫芦二烯醇水解为24,25-二羟基葫芦二烯醇 |
| Siraitia grosvenorii | 罗汉果苷生物合成（三萜类） | CYP87D18 | cytochrome P450 87D18 | 催化 | 催化24,25-二羟基葫芦二烯醇C-11羟基化生成罗汉果醇 |
| Siraitia grosvenorii | 罗汉果苷生物合成（糖基化步骤） | UGT720-269-1 | UDP-dependent glycosyltransferase 720-269-1 | 催化 | 催化C-3和C-24位糖基化生成罗汉果苷IIE |
| Siraitia grosvenorii | 罗汉果苷生物合成（糖基化步骤） | UGT94-289-3 | UDP-dependent glycosyltransferase 94-289-3 | 催化 | 连续催化C-24葡萄糖C-2'、C-6'及C-3葡萄糖C-6'糖基化生成罗汉果苷V |
| Glycyrrhiza uralensis | 甘草甜素生物合成（三萜类） | bAS | β-amyrin synthase | 催化 | 催化2,3-环氧鲨烯环化生成β-香树脂醇 |
| Glycyrrhiza uralensis | 甘草甜素生物合成（三萜类） | CYP88D6 | β-amyrin 11-oxidase (P450) | 催化 | 催化β-香树脂醇C-11连续两步氧化生成11-氧代-β-香树脂醇 |
| Glycyrrhiza uralensis | 甘草甜素生物合成（三萜类） | CYP72A154 | 11-oxo-β-amyrin 30-oxidase (P450) | 催化 | 催化11-氧代-β-香树脂醇C-30三步氧化生成甘草次酸 |
| Glycyrrhiza uralensis | 甘草甜素生物合成（糖基化步骤） | GuUGAT | UDP-dependent glucuronosyltransferase (UGT73 family) | 催化 | 催化甘草次酸C-3位连续两步葡萄糖醛酸糖基化生成甘草甜素 |
| Saccharomyces cerevisiae | 甲羟戊酸（MVA）途径 | tHMG1 | 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase | 催化 | 过表达反馈调节缺陷型以提高MVA通量 |
| Saccharomyces cerevisiae | MVA途径/甾醇生物合成 | UPC2 | 转录因子Upc2p | 调控 | 突变型upc2-1上调甾醇合成基因，增加代谢通量 |
| Saccharomyces cerevisiae | 三萜生物合成（竞争途径） | ERG7 | lanosterol synthase | 催化 | 用甲硫氨酸阻遏启动子替换内源启动子以减少竞争 |
| Saccharomyces cerevisiae | 脂质代谢/内质网形态 | PAH1 | 磷脂酸磷酸酶 | 区室化 | 敲除PAH1导致内质网扩张，促进膜结合酶表达和三萜积累（提高16倍） |
关键发现
- 甜菊叶中甜菊糖苷累积量可达叶片干重的10-20%；甜菊苷甜度为蔗糖的150-250倍，莱鲍迪苷A为200-300倍。
- 罗汉果苷V在鲜果果肉中约占1%，占罗汉果苷的20%，甜度超过蔗糖300倍。
- 甘草甜素在甘草根中占干重的2-8%，甜度约为蔗糖的150倍。
- 高甘草酸产生菌株中bAS、CYP88D6、CYP72A154转录水平比低产菌株高7-15倍。
- 乌拉尔甘草基因组约379 Mb（占预期94.5%），编码34,445个蛋白。
- CYP88D6催化β-香树脂醇C-11连续两步氧化；CYP72A154催化11-氧代-β-香树脂醇C-30三步氧化。
- GuUGAT催化甘草次酸连续两步葡萄糖醛酸糖基化生成甘草甜素。
- PAH1基因破坏使酿酒酵母中三萜积累提高16倍，青蒿酸产量提高2倍。
研究结论
甜菊糖苷、罗汉果苷和甘草甜素的生物合成途径关键酶已基本阐明，利用酿酒酵母等微生物异源表达这些基因可实现天然甜味剂的可持续生产；进一步优化代谢通量、内质网形态及糖基转移酶可提高产量和纯度。