Efficient enzymatic production of rebaudioside A from stevioside
- 作者
- Yu Wang, Liangliang Chen, Yan Li, Yangyang Li, Ming Yan, Kequan Chen, Ning Hao, Lin Xu
- 单位
- College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering, Nanjing Tech University, Nanjing, China
- 杂志
- Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry（2015）
- DOI
- 10.1080/09168451.2015.1072457
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
甜菊苷（stevioside）具有苦味余味，而莱鲍迪苷A（rebaudioside A）口感更佳。如何高效地将甜菊苷酶法转化为莱鲍迪苷A，以提高甜菊糖苷产品中莱鲍迪苷A/甜菊苷的比例，改善产品风味。
研究策略
偶联甜菊来源的UDP-葡萄糖基转移酶UGT76G1和拟南芥来源的蔗糖合酶AtSUS1，通过AtSUS1原位再生UDP-葡萄糖，以少量UDP替代昂贵的UDP-葡萄糖作为初始底物，实现甜菊苷到莱鲍迪苷A的高效酶法转化。
核心内容
该研究构建了一个双酶偶联系统，在大肠杆菌中共表达甜菊来源的UDP-葡萄糖基转移酶UGT76G1和拟南芥来源的蔗糖合酶AtSUS1，以蔗糖为糖基供体底物，通过AtSUS1原位再生UDP-葡萄糖，仅需微量UDP即可启动甜菊苷向莱鲍迪苷A的酶法转化。实验结果显示，在2.4 mM甜菊苷、7.2 mM蔗糖和0.006 mM UDP的条件下反应30小时，莱鲍迪苷A产率达78%；在0.6 mM甜菊苷底物体系中，偶联蔗糖合酶后24小时莱鲍迪苷A浓度达0.29 mM，为无蔗糖对照组的3.2倍。此外，初始底物摩尔比为甜菊苷:UDP:蔗糖=1:0.01:1时，24小时产率可达48%，表明极低浓度的UDP即可有效驱动反应循环。该策略通过辅底物原位再生大幅降低了生产成本，同时避免了高浓度UDP对糖基转移酶的抑制作用，为甜菊糖苷产品的风味改良提供了一条经济高效的酶法转化路径。
创新点
将UGT76G1和AtSUS1在大肠杆菌中共表达，构建双酶偶联系统；以UDP为起始物循环再生UDP-葡萄糖，大幅降低辅底物成本；在低UDP浓度下减少UDP对糖基转移酶的抑制，提高转化效率。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli Rosetta (DE3) | 甜菊糖苷生物合成 | UGT76G1 | UDP-葡萄糖基转移酶 UGT76G1 | 催化 | 来自甜菊（Stevia rebaudiana），催化甜菊苷糖基化生成莱鲍迪苷A |
| Escherichia coli Rosetta (DE3) | 蔗糖代谢/UDP-葡萄糖再生 | AtSUS1 | 蔗糖合酶 AtSUS1 | 催化 | 来自拟南芥（Arabidopsis thaliana），催化蔗糖和UDP生成UDP-葡萄糖和果糖，实现UDP-葡萄糖循环再生 |
| Escherichia coli Rosetta (DE3) | 甜菊糖苷生物合成 | pEUGT-SUS | — | 调控 | 共表达UGT76G1和AtSUS1的质粒，由T7启动子驱动多顺反子表达 |
关键发现
- 在30 h、2.4 mM甜菊苷、7.2 mM蔗糖和0.006 mM UDP条件下，莱鲍迪苷A产率达78%
- 在0.6 mM甜菊苷、0.12 mM UDP-葡萄糖和0.6 mM蔗糖体系中，24 h莱鲍迪苷A浓度为0.29 mM，是无蔗糖对照（0.09 mM，产率15.3%）的3.2倍
- 初始甜菊苷:UDP-葡萄糖:蔗糖摩尔比为1:0.5:1时，24 h产率达50%（0.30 mM）
- 使用0.006 mM UDP（甜菊苷:UDP:蔗糖=1:0.01:1）时，24 h莱鲍迪苷A浓度为0.29 mM，产率48%，为三组中最高
- 在UGT76G1活性测定中，1 mM甜菊苷和2 mM UDP-葡萄糖反应2 h生成0.28 mM莱鲍迪苷A。
研究结论
通过共表达UGT76G1和AtSUS1并偶联其活性，实现了从甜菊苷到莱鲍迪苷A的高效酶法合成；AtSUS1能够高效再生UDP-葡萄糖，使少量UDP即可替代UDP-葡萄糖启动反应，显著提高系统经济性。